ヒト肝P-450の酵母内発現とそのカクテルによる肝薬物代謝の予測法の開発

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557113
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 加藤 隆一 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40112685)
• 研究分担者: 宮道 慎二 明治製菓(株), 薬品総合研究所・探索研究所・微生物, 室長 ; 甲斐 文夫 明治製菓(株), 薬品総合研究所・新薬研究所, 所長 ; 永田 美樹 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10196488) ; 永田 清 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80189133) ; 安盛 俊雄 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (70182350)
• キーワード: ヒト肝 / 薬物代謝酵素 / チトクロムP-450 / 異所的発現 / ヒト薬物代謝能

研究概要

異種細胞にヒトチトクロ-ムP450を生産しようとする場合、ヘムを抱合するホロタンパクとして発現する必要がある。酵母にチトクロ-ムP450を導入するとヘムを含まないアポタンパクが多く生成する。そこでP-450human-2cDNAを用いて発現の改良を試みた。ヘミンの添加、酵母菌株の修飾、培養条件の変更等を試み、菌株NT8-1よりpﾟ菌株を作成しこれを宿主に用いることにより、ヘムの含有率向上を目指している。
NADPH-cyt.P450還元酵素、cyt.b_5との共発現による活性の向上についてはNADPH-cyt.P450還元酵素cDNAを得てプラズミドに組み込み、現在既に作成したcyt.b_5プラズミドと共にCOS-1細胞に導入して共発現による各cDNA由来タンパクの発現への影響を検討している。複数のP450分子種を発現し至適導入比率条件を検討している。
酵母発現P450human-2を用いてこのヒトP450の基質特異性を検討し、新たにフェニトインやシクロホスファミドの代謝活性を持つことが明らかとなった。ヒト肝には薬物代謝に関与する数多くのP450が含まれている、現在CYP3A4のcDNAについて発現用のプラズミドを作成している。またCYP2D酵素遺伝子の単離を行なうためにヒト肝cDNAライブラリ-よりスクリ-ニングを行なっている。

研究成果

• [文献書誌] Yasumori,T.: "Cytochrome P-450 human-2(P-450IIC9)in mephenytoin hydroxylation polymorphism in human livers:Differences in substrate and stereoselectivities among microheterogeneous P-450IIC species expressed in yeast." J.Biochem.109. 711-717 (1991)
• [文献書誌] Miyata,M.: "A Gene structure of testosterone 6β-hydroxylase(P450IIIA)" Biochem.Biophys.Res.Commun.177. 68-73 (1991)
• [文献書誌] Chen,L.: "Evidence for correlation of microsomal tolbutamide hydoxylation with S-mephenytoin hydroxylation polymorphism in Japanese livers,mediated by P-450 human-2(a form of P450IIC9)" Pharmacogenetics.
• [文献書誌] Kato,R.: "Xenobiotics and Cancer" Japan Sci.Press/Taylor & Francis, 9 (1991)