分化誘導した巨核芽球細胞における情報変換酵素ホスホリパ-ゼの活性制御機構

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03670121
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 岡野 幸雄 岐阜大学, 医学部, 助教授 (10177066)
• 研究分担者: 坂野 喜子 岐阜大学, 医学部, 助手 (50116852)
• キーワード: ホスホリパ-ゼC / アラキドン酸遊離 / ジアシルグリセロ-ル / カルシウムイオン / チロシンキナ-ゼ

研究概要

1.Furaー2標識したヒト巨核芽球CMK細胞をトロンビンおよびトロンボキサンA_2アナログのSTA_2で刺激すると細胞内Ca^<2+>が一過性に上昇した。
2.[ ^3H]アラキドン酸標識CMK細胞をトロンビン刺激すると、著明なアラキドン酸遊離を認めたが、ホルボ-ルエステル(PMA)の単独刺激では有意の遊離はみられなかった。一方、予めPMAで前処置した細胞をトロンビン刺激するとアラキドン酸遊離は相乗的に促進された。
3.トロンビン刺激したCMK細胞のDG量をDGキナ-ゼを用いて定量すると2相性のDG産生を認めた。1相目のピ-クは刺激後10秒で、2相目のピ-クは5分であった。[ ^3H]ミリスチン酸標識細胞の刺激時にはホスホリパ-ゼD活性の指標としてよく用いられるホスファチジルエタノ-ル(PEt)の産生を認め、2相目のDGがホスホリパ-ゼDを介した経路で産生されることが示唆された。
4.ラット巨核球cDNAライブラリ-をニワトリvーsrcのcDNA(C末側触媒部位をコ-ドする約600塩基対)をプロ-ブとしてスクリ-ニングし、8種の陽性クロ-ンを得た。これらのクロ-ンの部分塩基配列は、fyn、hck、lckなどのsrc型チロシンキナ-ゼと高い相同性を示した。
5.ラットhckcDNAをクロ-ン化し、その全塩基配列を決定した。ラットhckは全長1911塩基対からなり、マウスhckとの相同性は93.6%であった。184番目のATGコドンに始まり1693番目のTGAコドンに終止するopen reading frameは503アミノ酸残基をコ-ドし、分子量は57.126と推定された。アミノ酸レベルでのマウスhckとの相同性は97.6%であった。このhckはチロシンキナ-ゼに共通のいわゆるSH2およびSH3領域を有し、ATP結合部位、自己リン酸化部位、負の制御因子として知られる499番目のチロシン残基も保存されていた。またalternative splicingによる異種のhckcDNAは存在しないと考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Y.Okano: "Calcium oscillation induced by bradykinin in polyoma middle T antigenーtransformed NIH3T3 fibroblasts:Evidence for dependence on protein kinase C." Biochem.Biophys.Res.Commun.176. 813-819 (1991)
• [文献書誌] Y.Okano: "Identification of rat cDNA encoding hck tyrosine kinase from megakaryocytes." Biochem.Biophys.Res.Commun.181. 1137-1144 (1991)
• [文献書誌] T.Fu: "Differential pathways,phospholipase C and phospholipase D,of bradykininーinduced biphasic 1,2ーdiacylglycerol formation in NIH3T3 fibroblasts and its Kーrasーtransーformed cells:Involvement of intracellular calcium oscillations in phosphatidylーcholine breakdown." Biochem.J.
• [文献書誌] Y.Banno: "Isolation of a polyphosphoinositideーphospholipase C(type β)from cytosolic and membrane fractions of human platelets." Platelets.
• [文献書誌] T.Suzuki: "Isolation of two forms of phosphatidylnositol 4ーphosphate 5ーkinase from human platelet membrane." Thromb.Res.64. 45-56 (1991)
• [文献書誌] Y.Banno: "Effects of gelsolin on human platelet cytosolic phosphoinositideーphospholipase C isozymes" J.Biol.Chem.
• [文献書誌] Y.Nozawa: "Methods in Enzymology,197(Phospholipases)Phosphatidylinositolーspecific phospholipase C from human platelets" Academic Press, 9 (1991)