1991 年度実績報告書

2種類の基質を認識するトランスアミナ-ゼの蛋白工学的解析

研究課題

研究課題/領域番号	03670132
研究機関	大阪大学
研究代表者	倉光成紀大阪大学, 理学部, 教授 (60153368)
キーワード	酵素 / 蛋白質工学 / 基質認識機構 / 触媒反応機構 / 部位特異的変異法 / 量産化 / X線結晶解析 / アスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼ
研究概要	アミノ基転移酵素であるアスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼは、酸性側鎖を持つアミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)と中性側鎖を持つアミノ酸(例えば、メチオニン、フェニルアラニン)の間のアミノ基転移反応を触媒する。従来の「一基質一酵素」の考え方からすると性質の異なった2つの基質結合ポケットが存在するのは奇妙に思われるが、アミノ基転移酵素のように異なったアミノ酸基質の間でアミノ基転移を行う酵素の場合にはこの方が都合が良いと思われる。今までに、基質特異性が低く何種類かの基質に作用する酵素は知られているが、アミノ基転移酵素のように2種類の基質に対してそれぞれ高い特異性を示す酵素は今までほとんど知られていない。これら2つのポケットの立体構造を明らかにする目的で、まず、酵素と酸性基質との複合体についてX線結晶解析を行ったところ、酸性基質側鎖のCOO^-はArg292と静電的相互作用をする事が明らかになった。次に、酵素と中性基質との複合体のX線結晶解析も試みたが、まだ成功していない。そこで、コンピュ-タ-グラフィックスを用いて中性基質結合部位を予測したところ、この候補として2箇所が考えられた。いずれが中性基質結合部位かを確かめるために、予測された2箇所のポケットに存在するアミノ酸約15残基を遺伝子操作法で置換した。得られた変異型酵素を量産化し、酸性基質および中性基質との反応性を、ストップトフロ-法などの分光学的方法で解析した。その結果、コンピュ-タ-グラフィックスで予測された2つのポケットのいずれにも、中性基質は結合しないことが示唆された。そこで、酵素分子全体を広くスクリ-ニングして、中性基質結合部位を検索しつつある。

研究成果

(8件)

すべてその他

すべて文献書誌 (8件)

[文献書誌] M.ーH.Sung: "Thermostable Aspartate Aminotransferase from a Thermophilic Bacillus Species Gene Cloning,Sequence Determination,and Preliminary XーRay Characteriztion" Journal of Biological Chemistry. 266. 2567-2572 (1991)
[文献書誌] K.Inoue: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase:Contribution of the Hydrogen Bond between Tyr225 and Coenzyme to the Catalytic Reaction" Journal of Biochemistry(Tokyo). 109. 570-576 (1991)
[文献書誌] T.Yano: "The Role of His143 in the Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" Journal of Biological Chemistry. 266. 6079-6085 (1991)
[文献書誌] H.Hayashi: "Replacement of an Interdomain Residue Val39 of Escherichia coli Aspartate Aminotransterase Affects the Catalytic Competence without Altering the Subnit Specificity of the Enzyme" Journal of Biochemistry(Tokyo). 109. 699-704 (1991)
[文献書誌] K.Inoue: "SiteーDirected Muragenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:Role of Tyr70 in the Catalytic Processes" Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)
[文献書誌] T.Yano: "The Role of Asp222 in the Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:AminoーAcid Residue Which Enhances the Function of the EnzymeーBound Coenzyme,Pyridoxal 5'ーPhosphate" Biochemistry. 31. (1992)
[文献書誌] 倉光成紀(共著): "タンパク質立体構造の新しい視点" 講談社, 177 (1991)
[文献書誌] 倉光成紀(共著): "新生化学実験講座第1巻 V.酵素・その他の機能タンパク質" 東京化学同人, (1991)

1991 年度 実績報告書

2種類の基質を認識するトランスアミナ-ゼの蛋白 工学的解析

研究代表者

倉光 成紀 大阪大学, 理学部, 教授 (60153368)

研究成果

[文献書誌] M.ーH.Sung: "Thermostable Aspartate Aminotransferase from a Thermophilic Bacillus Species Gene Cloning,Sequence Determination,and Preliminary XーRay Characteriztion" Journal of Biological Chemistry. 266. 2567-2572 (1991)

[文献書誌] K.Inoue: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase:Contribution of the Hydrogen Bond between Tyr225 and Coenzyme to the Catalytic Reaction" Journal of Biochemistry(Tokyo). 109. 570-576 (1991)

[文献書誌] T.Yano: "The Role of His143 in the Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" Journal of Biological Chemistry. 266. 6079-6085 (1991)

[文献書誌] H.Hayashi: "Replacement of an Interdomain Residue Val39 of Escherichia coli Aspartate Aminotransterase Affects the Catalytic Competence without Altering the Subnit Specificity of the Enzyme" Journal of Biochemistry(Tokyo). 109. 699-704 (1991)

[文献書誌] K.Inoue: "SiteーDirected Muragenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:Role of Tyr70 in the Catalytic Processes" Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

[文献書誌] T.Yano: "The Role of Asp222 in the Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:AminoーAcid Residue Which Enhances the Function of the EnzymeーBound Coenzyme,Pyridoxal 5'ーPhosphate" Biochemistry. 31. (1992)

[文献書誌] 倉光 成紀(共著): "タンパク質立体構造の新しい視点" 講談社, 177 (1991)

[文献書誌] 倉光 成紀(共著): "新生化学実験講座 第1巻 V.酵素・その他の機能タンパク質" 東京化学同人, (1991)

1991 年度実績報告書

2種類の基質を認識するトランスアミナ-ゼの蛋白工学的解析

倉光成紀大阪大学, 理学部, 教授 (60153368)

[文献書誌] 倉光成紀(共著): "タンパク質立体構造の新しい視点" 講談社, 177 (1991)

[文献書誌] 倉光成紀(共著): "新生化学実験講座第1巻 V.酵素・その他の機能タンパク質" 東京化学同人, (1991)