| 研究概要 |
RNaseHによるsubtraction libraryの確立とその応用により、退縮している尾に特異的に発現している遺伝子のクロ-ニングを行なった。
1,RNAとそれに相補的一本鎖DNAを合成し,そのhybridizationの温度,時間,緩衝液の組成の違いによるRNAの安定性,hybrid形成の効率などを調べた。そしてhybrid形成に関与したRNAのRNaseHによる分解の条件(温度,時間,酵素量)などを検討した。RNAとDNAが相補的な場合には99%以上のRNAが分解されるが,そうでない場合にはRNAが安定に存在する条件をほぼ決めた。それにより特異的なRNAのみを選択することができると考えられる。
2.1に基づき,RNaseHによるsubtraction libraryの手法をおおむね確立した。退縮前の尾からmRNAを抽出し,cDNAを合成し,それに少量の退縮中の尾のmRNAをまぜ,hybridizationさせ,RNaseH処理をした。この操作により,退縮中の尾に特異的なものだけが残ることになる。そのmRNAからcDNAを合成し,PCRで増幅し,cDNAライブラリを作製した。退縮前/中の尾のmRNAから ^<32>pでラベルしたcDNAを合成し,これをプロ-ブとしてスクリ-ニングした。退縮中のプロ-ブだけがシグナルを出すクロ-ンのみを拾った。その結果得られた退縮中の尾に特異的な遺伝子を使ってRNaseHによるsubtraction libraryの効率をみると,15倍程にその遺伝子が濃縮されていた。現在までに退縮中の尾に特異的に発現している遺伝子をいくつか単離した。
3,退縮している尾に特異的に発現している遺伝子が実際にprogrammed cell deathに関与しているかどうかを調べるためには、functional assayの確立が必要である。その準備として退縮直前の尾からprimary cultureを始めた。現在,継代可能な細胞株がいくつかとれつつある。
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