| 研究課題/領域番号 |
03670137
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
佐藤 道比古 山形大学, 医学部, 助教授 (00135344)
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| 研究分担者 |
石川 和信 山形大学, 医学部, 助手 (80222959)
吉田 匡 山形大学, 医学部, 教授 (10004673)
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| キーワード | ヘムオキシゲナ-ゼ / ストレス関連蛋白質 / 転写調節 / カドミウム / CATアッセイ / 遺伝子発現 |
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| 研究概要 |
ラットヘムオキシゲナ-ゼは、種々の化学物質(重金属、有機化合物)や物理的刺激(紫外線、熱、X線)によって著明に誘導を受ける。これらの物質や刺激の共通点として、活性酸素分子種の生成がある。それらと本酵素誘導機構の関係を解明するため、研究を行い、以下の結果を得た。
1.ラットヘムオキシゲナ-ゼ遺伝子5'側1.4kbpをCAT遺伝子上流の組み込んだプラスミドを構築し、ラットグリオ-マ細胞(C6)に導入し、ヘミン、Cd^<2+>による転写活性の変化をCATアッセイで検討したが、コントロ-ルに比べ変化は認められなかった。そこで、ラットゲノムライブラリ-からヘムオキシゲナ-ゼ上流域をプルに比べ変化は認められなかった。そこで、ラットゲノムライブラリ-からヘムオキシゲナ-ゼ上流域をプロ-ブにしてスクリ-ニングを行い、約4kbp上流を含むクロ-ンを得た。本領域を上記と同様にCAT遺伝子上流に組み込み、ヘミン、Cd^<2+>による影響をCATアッセイで検討した。コントロ-ルに比べヘミンではCAT活性の上昇は見られなかったが、Cd^<2+>においては、約3〜20倍の上昇が見られた。この結果は、本領域にCd^<2+>による転写活性増大のための転写調節領域(シスエレメント)が存在することを示唆している。そこで本領域の部分欠損変位体を作成し、CATアッセイしたところ、ヘムオキシゲナ-ゼ転写開始点より上流側約2.6〜3.1kbpにCd^<2+>によるシスエレメントの存在を示唆する結果を得た。
2.ラットヘムオキシゲナ-ゼcDNAを動物細胞発現ベクタ-pSVLに組み込み、リン酸カルシウム法によりCOS細胞に導入した。本細胞を集め、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ニトロセルロ-ス膜に転写し、抗ヘムオキシゲナ-ゼ抗体を酵素抗体法による検出を試みた。ヘムオキシゲナ-ゼcDNAを導入した細胞では、コントロ-ルに比べ数十倍のヘムオキシゲナ-ゼ酵素蛋白質の存在が認められた。
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