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1.8D7モノクロ-ナル抗体の精製。プリスタン処理したBALBCマウスに、すでに申請者が開発しているラット肝細胞膜と特異的に反応するモノクロナ-ル抗体(8D7モノクロナ-ル抗体)産生ハイブリド-マを腹腔内投与し、腹水を採取し、プロテインAアフィニティカラムを用いて、8D7モノクロ-ナル抗体を精製分離した。
2.抗8D7イデオタイプ抗体検出のためのELISA法の設定。1)サンドイッチ法:精製した8D7モノクロ-ナル抗体に、horseradish peroxidaseまたはbiotinを標識した。ELISAプレ-トに、精製8D7モノクロ-ナル抗体を固相化したのち、検体を反応、続いて標識8D7モノクロ-ナル抗体を反応させ、biotin化抗体の場合はさらにstreptoavidin標識horseradish peroxidaseと反応させ発色、吸光度計にて測定した。2)8D7モノクロ-ナル抗体F(ab')2分画を用いる方法:精製した8D7モノクロ-ナル抗体マウスIgG1を、pepsinにてFc部分を除去し、F(ab')2分画を精製、これをELISAプレ-トに固相化し、検体と反応、続いてhorseradish peroxidase標識抗マウスIgGFc抗体と反応後発色、吸光度を測定した。
3.抗8D7イデオタイプ抗体の作成。精製8D7モノクロ-ナル抗体マウスIgG1を、cationized BSAまたはKeyhole Limpet Hemocyaninに結合し、アジュバンドとともにマウスを免疫した。数回の免疫の後、前述のELISAにてマウス血清を測定し抗体産生のあるマウスの脾細胞を取り出し、ミエロ-マ細胞と細胞融合し、ハイブリド-マを作成した。3回の細胞融合で216個のコロニ-が形成され、培養上清を前述のELISA法にてスクリ-ニングしたところ、うち2個のwellの培養上清が陽性であった。現在、この2つのクロ-ンについてサブクロ-ニングするとともに、その性状について解析中である。
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