|
1)プライマ-の合成;制限酵素EcoRI認識配列を有するオリゴプライマ-を合成した。
2)染色体マイクロディセクション;正常個体リンパ球を染色体分析と同じ方法で培養し、30本のX染色体からXp21部位をマイクロディセクション法にて切り出した。
3)マイクロクロ-ニング;切り出した染色体断片を集め、proteinaseK処理にてDNA抽出を行った。1)のプライマ-を混合してPGR法にてDNA増幅を施行。この一部を電気泳動すると50ー2000bp長のDNAのスメアであり、十分な長さのDNAが増幅されていた。PCR産物の一部をEcoRI消化後ベクタ-pUC18に組み込み、大腸菌DH5αに感染させ、プレ-ティングしてXーgalシステムでスクリ-ニングを行った。約500個のX染色体DNA断片を有すると思われるクロ-ンが得られた。Miniーprep法にて各クロ-ンDNAを抽出保存した。このうち10個のクロ-ンのインサ-トDNAの平均長は約300bpであった。
4)クロ-ンの選別;インサ-トDNAがX染色体由来であることを確認するためサザンブロット法を施行した。5XY個体および正常男性のHindIII消化DNAのブロットフィルタ-を10枚作成し、各インサ-トをプロ-ブとして順次サザン法を行い、X染色体由来かつsingle copyであるクロ-ンを選択した。現在8個のクロ-ンを得ている。
5)CGKD患者とのサザン法;集積した8名のCGKD患者の内、DMD遺伝子とプロ-ブC7との間に切断点を有する3名よりブロットフィルタ-を作成し、4)で得られたクロ-ンとサザン法を施行し、ハイブリダイズしないクロ-ンを選択する。現在1個のクロ-ンを得ている。
|
