脳移植としての脳内神経細胞への遺伝子導入の試みとその形態学的研究

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03670684
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 水川 公直 岡山大学, 医学部, 講師 (40137154)
• キーワード: 遺伝子導入 / プラスミドDNA / ベータ ガラクトシラーゼ / 酵素組織化学 / 免疫組織化学

研究概要

昨年度より、脳内に外来遺伝子の導入を計るのに必要な最適条件を見いだすべく、その基礎的検討をおこなってきた。本年度においても、pRSVLプラミスドDNAを用いて遺伝子導入をこころみた。そして、このプラミスドDNAをリボフェクチンで処理する際、pRSVLプラミスドDNAを20%のフルクトースに溶解して、CaのキレーターであるEGTAを添加したものをマウスの大腿筋にマイクロシリンジを用いて注入するという方法論の改善により、外来遺伝子導入の効率を上げることが可能になった。さらに、本年度にはこの方法を利用して、脳内への注入を試みた。具体的には、β‐galactosidaseの遺伝子を前もって、pRSVLプラセミドDNAに組み込ませ、このpRSV b‐galをマウスの大腿筋の筋肉に注入して、3日後と3週間後との異なる時間経過で外来遺伝子であるβ‐galactosidaseの発現を、酵素組織化学的およびガラクトシラーゼの抗体を利用して、免疫組織化学的に染色し、さらに電顕的に、その発現の微細構造を明らかにするべく研究をした。さらに、pRSV b‐galのみならず、L7RH b‐galを同様に注入して、プラセミドDNAの種類による遺伝子導入様式の違いについても検索した。その結果、pRSV b‐galを使用すると、遺伝子導入された筋肉ではブルーに染めだされ筋肉の全体にβ‐galactosidaseの発現が光顕的に認められた。この部位を電顕的に詳細に観察すると、筋原線維の間に針状結晶様の電子密度の高い構造物が認められ、これが酵素組織学的に染色されるものの微細構造であることが明らかとなった。また、L7RH b‐galを使ったときには、筋肉内の核の部分にのみ限局してその発現が認められ、電顕的にもそのことが証明することが出来、組み込みの際のプラスミドの種類により、その導入される遺伝子の発現様式が異なってくる事実があきらかになった。さらに、免疫組織化学的染色を試み、さらに詳細な検討を試みたが、バックグラウンドが高くうまく検索出来なっかった。現在、その原因について検討中である。また脳内への投与例について現在、光顕的や電顕的に検索しているが、良い結果が得られず、更に検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Asanuma,M.,et al.: "Distribution of the β-2 adrenergic receptor messenger RNA in the rat brain by in situ hybridization histochemistry:effects of chronic resepine treatment" Neurochemical Research. 16. 1253-1256 (1991)
• [文献書誌] Mizukawa.K.,et al: "Morphological investigation of iron-induced epileptic rats:with special reference to c-fos immunohistochemistry and iron staining" The Japanese Journal of Psychiatry and Neurology. 45. 285-289 (1991)
• [文献書誌] Mizukawa,K.,et al: "Changes of phorbol ester binding sites in rat brain following intracerebroventricular administration of thyrotropin-releasing hormone(TRH):an in vitro macroautoradiographic investigation" Neurochemical Research,. 17. 361-365 (1992)
• [文献書誌] Ono,K.,et al: "Abnormal expression of embryonic N-CAM in the developing mouse cerebellum after neonatal administration of cytosine arabinoside" Developmental Brain Research. 65. 119-122 (1992)
• [文献書誌] Ogawa,N.,et al: "Post-ischemic administration of bifemelane hydrochloride prohibits ischemia-induced depletion of the muscarinic Mlreceptro and its m RNA in the gerbil hippocampus," Brain Research. 591. 171-175 (1992)
• [文献書誌] Mizukawa,K.et al: "Alterations in benzodiazepine and γ aminobutyric acid (GABA)ergic receptors in Elmice:in vitro macroautotoradiographic investigation," Neurosciences 18 Supplement 2. 18. (1993)