| 研究概要 |
人血中アポリポ蛋白E(アポE)のレセプタ-結合ドメイン部(アミノ酸残基140ー160番目)内のDNAの点変異をスクリ-ニング的に見つけだす目的でpolymerase chain reaction(PCR)とGCクランプ法を用いた変性密度勾配電気泳動法を確立した。方法は、全血200μlよりゲノムDNAを抽出し、アポEのエクソン4上でアミノ酸残基140ー160残基を含む244bPのDNA断片をPCRにて増幅した。PCRは第1,第2プライマ-を用い,サ-マルサイクラ-にて95℃5分間熱変性後,95℃1分,60℃1分,70℃2分を30サイクル行った。次に第1プライマ-の5'測にG,Cで構成した40塩基フラグメントを付加した第3プライマ-と上記第2プライマ-にて再PCRを行った。これをアガロ-ス電気泳動でみると284bPに相当する単一バンドが得られ,この再PCR産物(GCクランプ)を用いて変性密度勾配電気泳動を行った。まず、7%ポリアクリルアミドゲルで泳動方向に垂直に0ー90%の尿素とフォルムアミドによる変性密度勾配をかけ、60℃の泳動槽にて泳動を行い、このDNAフラグメントでのメルティングドメインが変性密度75%前後にあることを確認した。以後は泳動方向と水平に65ー85%の変性密度勾配をかけ4時間泳動した。この条件で、表現型アポE3,4に対してレセプタ-結合ドメイン部の塩基配列が変異しているE2(158Arg->Cys)をみると,E3,4と異なる泳動パタ-ンを呈した。また,すでにアミノ酸配列の解っている変異種アポE Kochi 例(145Arg->His)を調べると,特異の泳動パタ-ンがみられ,変異の存在が同定できた。さらに、本DNAの直接シ-クエンスを行なったところ145ArgコドンCGTがHisコドンCATに点変異していることが判明した。本GDクランプ法で高脂血症例をスクリ-ニング開始したところバセドウ病に高脂血症を合併した例でアポE ochiと同様の変異が発見された。現在,多数の高脂血症例で検討を行っている。
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