| 研究課題/領域番号 |
03680147
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小堤 保則 京都大学, 薬学部, 助手 (70205425)
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| 研究分担者 |
岡 昌吾 京都大学, 薬学部, 助手 (60233300)
川嵜 敏祐 京都大学, 薬学部, 教授 (50025706)
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| キーワード | 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP) / イナゴ / 昆虫神経細胞 / 糖鎖 / ピリジルアミノ化 |
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| 研究概要 |
西洋ワサビペルオキシダーゼに対する抗体(anti-HRP)はイナゴを含む昆虫の神経系に特異的に存在する糖鎖を認識することが知られている。黒坂らは既にanti-HRPと反応性を示す糖鎖をHRPより単離し、その構造を決定している(Manα1→6(Manα1→3)(Xylβ1→2)Manβ1→4GlcNAcβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc)。本研究では実際に昆虫の神経細胞に発現している糖鎖がHRPの糖鎖と同じかどうかを明らかにする目的で、イナゴ頭部よりanti-HRPと反応性を示す糖タンパク質を精製し、その性質を検討した。
イナゴ頭部をクロロホルム/メタノール(2:1)で脱脂した後、0.9%NaClを含むリン酸緩衝液で抽出した。抽出物の20-80%硫安沈殿画分をさらにコンカナバリンA、レンチルを用いたレクチンアフィニティークロマトグラフィー及びpheny15PWを用いたHPLCにより分画しanti-HRPと反応性を示す糖タンパク質を精製した。anti-HRPと反応性を示す糖タンパク質の検出には、HRPの糖鎖を固定化したウェルを用いたELISA法あるいはウエスタンブロットにより行なった。精製した糖タンパク質の糖組成はマンノース、N-アセチルグルコサミン、フコースが主成分でありHRPに存在していたキシロースはみられなかった。また、α-マンノシダーゼ消化することによりanti-HRPとの反応性が消失したことから、エピトープとしてα-結合のマンノース残基の存在が示唆された。さらにこの糖タンパク質に含まれる糖鎖の構造を解析するために、精製した糖タンパク質をヒドラジン分解後、遊離した糖鎖をピリジルアミノ化(PA化)した。 このPA化糖鎖を陰イオン交換カラム、逆相カラム、アミノカラムを用いたHPLCにより分画し数種類の糖鎖画分を得た。これらはいずれも哺乳動物由来の糖鎖に比ベて短い特色を示した。
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