外因系血液凝固機構の研究

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03680151
• 研究機関: 国立循環器病センター
• 研究代表者: 宮田 敏行 国立循環器病センター研究所, 脈管生理部, 室長 (90183970)
• 研究分担者: 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• キーワード: 血液凝固 / 組織因子 / 血栓形成 / 酵母による発現

研究概要

1.可溶性ヒト組織因子ーVIIa因子複合体の酵素学的性質
酵母で発現させた可溶性ヒト組織因子を用いて、VIIa因子の酵素学的性質に検討を加えた。組織因子ーVIIa因子複合体の酵素活性を測定するため、25種の蛍光性ペプチド基質をスクリーニングしたところ、Boc-Leu-Thr-Arg-McAが最も良い基質であることが判明した。この他にも、Boc-Val-Val-Arg-McA、Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-McA、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-McAも良い基質であった。VIIa因子単独の場合と組織因子と複合体を形成した時のパラメーターを比べると、Km値には変化を認められなかったものの、kcat値が約150倍上昇した。したがって、組織因子はVIIa因子の酵媒効率を上昇させる。また、組織因子ーVIIa因子複合体の酵素活性はヘパリン存在下で血漿中のアンチトロンビンIIIで阻害された。また、この時VIIa因子ーアンチトロンビンIII複合体の形成が観察された。
2.可溶性変異ヒト組織因子の発現
3ヶ所の糖鎖結合部位のAsn残基をAlaに変異した可溶性組織因子を発現させ、発現収率の向上を図るとともに糖鎖の機能の解析を試みた。3ヶ所のAsn残基を全てAlaに変異すると発現量が2%に減少した。プロテアーゼにより分解されたと考えられるため、糖鎖は本因子の安定性に重要であると考えた。Asn-137をAlaに変異したものは37kDaの可溶性組織因子の収率が2倍に上昇した。これにより、大量の可溶性組織因子の調製が可能となった。

研究成果

• [文献書誌] Y.Shigematsu: "Expression of Human Soluble Tissue Factor in Yeast and Enzymatic Rroperties of Its Complex with Factor 7a" J.Biol.Chem.267. 21329-21337 (1992)
• [文献書誌] T.Miyata: "Prothrombin Salakta:Substitution of glutamic acid-466 by alanine pedues the fibrinogen clotting activity and the esterase activity" Biochemistry. 31. 7457-7462 (1992)
• [文献書誌] A.Nakashima: "Human fibrinogen heterogeneity:the cooH-terminal residues of defective Aα chains of fibrinogen 2." Blood Coagulation and fibrinolysis. 3. 361-370 (1992)
• [文献書誌] H.Tsuda: "Analysis of intrinsic fibrinolysis in human plasma induced by dextran sulfate" Thromb.Haemost.67. 440-444 (1992)
• [文献書誌] 宮田 敏行: "血管と内皮、フィブリンの形成と溶解" メディカルレビュー社, 7 (1992)
• [文献書誌] 宮田 敏行: "医学のあゆみ,血液凝固IX因子ー構造と機能" 医歯薬出版, 4 (1992)