真核生物の活性酸素に対する防御・適応機構の解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03680225
• 研究機関: 放射線医学総合研究所
• 研究代表者: 稲葉 浩子 放射線医学総合研究所, 遺伝研究部, 主任研究員 (70159953)
• 研究分担者: 島津 良枝 放射線医学総合研究所, 薬理化学研究部, 主任研究員 (10162687) ; 森明 充興 放射線医学総合研究所, 遺伝研究部, 室長 (00166430)
• キーワード: 活性酸素 / 活性酸素増産剤 / Mutant / S.pombe / CHO・KI / DNA repair / 適応応答 / 遺伝子クローニング

研究概要

1.活性酸素防御系ヒト遺伝子のクローニング
酵母の活性酸素ならびに放射線防御に関与するDNA修復遺伝子〓〓〓〓〓〓をプローブとして、ヒトcDNAライブラリーとSouthern hybridizationを行い、ヒトの相同遺伝子を単離する条件を検討した。lambdaファージに組み込んだヒトcDNAライブラリー5x10^5クローン当たり約100個のcandidate cloneが検出された。各々のDNA塩基配列を決定し、〓〓〓〓〓〓のcounterpartの特定を進めている。
2.適応応答系酵母遺伝子のクローニング
S.pomheのゲノム断片に大腸菌の〓〓〓〓遺伝子を連結した融合遺伝子ライブラリーを作成し、活性酸素等のストレスにより発現が増加する酵母の遺伝子71個を単離した。これら融合遺伝子の〓〓〓〓との結合部分のDNA塩基配列を決定して26の遺伝子を確認した。これらは殆ど新しい遺伝子であり主として2次的に発現していると推定された。
3.CHO・KI細胞の活性酸素増産剤感受性変異株の解析
CHO・KI細胞より分離したplumbagine高感受性変異株のうちMelyl Viologen(MV)に対しても感受性の高い4株は、MVに対してI ,II,IIIの遺伝的相補グループに分けられた。このうちIIとIIIの株は、活性酸素を生成しDNAに架稿などの障害を与えるMitomycin Cや〓〓〓pl(II)にも高感受性であり、DNA損傷の修復に欠損があると推定される。グループI では、そのcytosolで安定ラジカル消去能の減少が認められた。これらの変異株に、ヒトDNAを種々の方法で導入し、相補するヒト遺伝子のクローニングを進めている。
4.その他、この課題の発展に必要な遺伝子クローニングのための技術開発、またDNA修復や活性酸素の生成、消去に関連する研究を行った。

研究成果

• [文献書誌] M.Morimyo,I.Machida,E.Hongo,T.Saeki,H.Hama-Inaba: "DNA Repair Gene radM12 of S.pombe Encoding a Novel Ubiquitin Conjugating Enzyme." Natl.Inst.Sci.Ann.Rept.32. 50-51 (1993)
• [文献書誌] M.Morimyo and K.Mita,: "A Simple and Rapid Amplification Procedure for cDNA Cloned in Dephosphorylated Plasmid" Nucleic Acids Research.21(7). 1679-1680 (1993)
• [文献書誌] E.Hongo,M.Morimyo,H.Hama-Inaba,I.Machida: "Cloning of Stress Inducible Gene of S.pombe." J. Radial.Res.34. 317 (1993)
• [文献書誌] T.Ozawa,J.Ueda and Y.Shimazu.: "DNA Single Stland Breakage by Copper(II) Complexes and Hydrogen peroxide at Physiological Conditions" Biochemistry and Molecular Biology Int.31. 455-461 (1993)
• [文献書誌] H.Hama-Inaba,Y.Shimazu. M.Takusagawa,et al.: "Characterization of CHO CellMutants Sensitive to Active OxygenPropagators." Proc.VIth Int.Conf.Superoxide and Superoxide Dismulase, Elsevier Science Publishers. in press. (1994)
• [文献書誌] Y.Shimazu,H.Hama-Inaba,O.Yukawa ,and T.Ozawa,: "Modification of Cytochrome C Method to Determine Superoxide Dismutase Activity in Living Organisms." Proc.VIth Int.Conf.Superoxide and Superoxide Dismutase, Elsevier Science Publishers. in press. (1994)
• [文献書誌] I.Machida,M.Morimyo, T.Saeki.: "Aberrant Transformation of Error-Prone Repair-Deficient Mutants rad6-1 and rad18-2 of Saccharomyces cerevisiae by Integrating Plasmid Y1p5." J.Radiat. Res.in press. (1994)
• [文献書誌] K.Mita,M.Morimyo,E.Hongo,: "One Step DNA Sequencing of Single-Stranded DNA with Reverse Dye-Primer." Nucleic Acids Res.in press. (1994)