| 研究概要 |
昨年度,ニジマス肝蔵より常法に従ってDNAを抽出し、XbaI断片約25KbのDNAをcharomid9ー28をベクタ-として、geromic DNA部分ライブラリ-を作製した。このライブラリ-より、大阪大学、谷口維紹教授より分与を受けたヒトインタ-フェロンβのcDNAをプロ-ブとして陽性シグナルを示すコロニ-を釣り上げた。
ところが、この陽性シグナルを示したcharomid(RTINFβー1)からインサ-トXbaI断片を切り出し、種々の制限酵素で切断して後、ヒトインタ-フェロンBcDNAをプロ-ブとしてハイブリダイゼイションを行ったところ、プロ-ブDNAと相同性を示すバンドは検出できなかった。原因としてクロ-ニングのために使用したプロ-ブへのベクタ-pBR322の混入を疑い、精製度を高めたヒトインタ-フェロンβのプロ-ブと前に用いたものを用いて、RTINFβー1のインサ-ト及びベクタ-XbaI断片をサザンハイブリダイゼ-ションした。その結果、釣り出しに用いたプロ-ブにはわずかなPBR322断片の混入があり、これがCharomid9ー28とハイブリしたため、陽性シグナルを形成したことが明らかになった。また昨年度、ハイブリゼイションの最適条件として選んだ、4×SSC,60℃オ-バ-ナイトハイブリダイゼ-ション、3×SSC,55℃、30分の洗浄条件では、為陽性シグナルを拾う確率が高いこともわかり、6×SSC,65℃,オ-バ-ナイトハイブリダイゼ-ション、15×SSC,65℃、15℃の洗浄条件の方がよいことも明らかになった。
現在、再度、ニジマスのgenomic DNAライブラリ-を作製し、新たに調製したプロ-ブを用いて陽性シグナル(RTINFPー2)の釣り対しに成功したので、制限酵素地図の作製を試み、釣り出したgeneの解析を急いでいる。
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