| 研究課題/領域番号 |
03807143
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物理系薬学
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
古田 隆 東京薬科大学, 薬学部, 助教授 (70120152)
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| 研究分担者 |
柴崎 浩美 東京薬科大学, 薬学部, 助手 (20206121)
粕谷 泰次 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (90096686)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1992
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| キーワード | _L-ヒスチジン / ウロカニン酸 / ヒスチジン アンモニア・リアーゼ / 酵素反応機構 / β-脱離反応 / 可逆反応性 / 安定同位体 / 重水素-水素交換 |
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| 研究概要 |
本研究では、重水素標識された _L-ヒスヂンを用いて、ヒスジンアンモニア・リアーゼ(ヒスチダーゼ)によるin vitro酵素反応を行い、重水素-水素交換の経時変化から、 _L-ヒスチジンからウロカニン酸へのアミノ基脱離反応は、可逆的stepwise機構で進行することを証明した。
_L-ヒスチジンのイミダゾール環5′位を重水素標識したL-[5′- ^2H]Histidineを基質として、20℃、pH7.0あるいはpH9.0の条件下でヒスチダーゼ酵素反応を行い、 _L-ヒスチジンおよびウロカニン酸の各イミダゾール環5′位の水素交換を24時間にわたり経時的に追跡した。なお、水素交換の程度はcapillary GC-MS-SIM法にて測定した。ヒスチダーゼ酵素反応において、 _L-[5′- ^2H]Histidineは、カルバニオンを経て、主として5′位重水素を保持した[5′- ^2H]Urocanic acidに至る。生成した[5′- ^2H]Urocanic acidの一部は、可逆反応により再びカルバニオンを経て5′位の重水素が水素交換し、Urocanic acidに至る。さらに、 _L-ヒスチジンの5′位における重水素も、中間体であるカルバニオンを介して水素交換していることが明らかとなった。また、カルバニオン(中間体)とウロカニン酸(生成物)過程の可逆反応性(Step2)の方が、 _L-ヒスチジン(基質)とカルバニオン(中間体)の過程における可逆反応性(Step1)よりも全可逆反応性に対して大きく寄与していることが明らかとなった。この水素交換の程度から、本酵素反応におけるカルバニオン中間体は、pH7.0における方が、pH9.0のときよりも安定であることが示された。
本研究において解明されたヒスチターゼ酵素反応における可逆反応機構は、健常人ならびにヒスチジン血症の患者における _L-ヒスチジンの生体内代謝機構の直接解明を行ううえで重要な指針を提供したものと考える。
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