| 研究概要 |
FUT8はアスパラギン結合型糖鎖の根元のN-アセチルグルコサミン残基にα1,6フコースを付加する酵素で、この酵素により独立した糖鎖モジュールが形成されるので、ノックアウトマウスでみられる病状を、この糖鎖モジュールの欠損の結果と考えることができる。糖鎖の役割は、それが付加される糖タンパク質が同定されれば、ノックアウトマウスの病態を詳細に解析することによりおおよその見当がつくと思われる。
FUT8ノックアウトマウスで病変が明らかとなった臓器に関して、まず、野生型マウスとFUT8ノックアウトマウスの小腸から膜タンパク質を抽出し、全膜タンパク質をリジルエンドペプチダーゼで分解し、ペプチドあるいは糖ペプチドの断片に限定分解しました。これをAALレクチンカラムにかけてα1,6フコースを持つ糖ペプチドのみを分離する条件を確立した。その後、N-グリカナーゼを働かせて糖鎖を根こそぎ外した。このペプチド混合物を逆相HPLCにかけて相互分離する方法を確立した。
その方法で分離された各ピークをMALDI-TOFMSで解析して質量を同定し、データベースを検索することにより、どのタンパク質のどのペプチド部分が回収されたかを調べています。
その中で、一つのタンパク質についてそのタンパク質を認識する抗体で免疫沈降した後、レクチンブロッティング方法でα1,6フコースを持ってることを確認した。
来年もつづけて、この方法でそれぞれの臓器や分泌タンパク質に関しても、血清タンパク質や培養細胞の無血清培養液を材料として用いて、同様の解析を行う予定である。
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