タンパク質の熱物性・生物機能と立体構造の動的性質の相関々係

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04044068
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (60167301)
• 研究分担者: 有坂 文雄 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (80133768) ; 勝部 幸輝 大阪大学, タンパク質研究所, 教授 (20032013) ; 田中 信夫 東京工業大学, 生命理学科, 教授 (50032024) ; PETER Zavods ハンガリー国立科学アカデミー, 研究所, 教授 ; GREGORY Pets Braudeis大学, 化学科, 教授
• キーワード: 好熱菌 / ^<3->イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 耐熱性酵素 / キメラ酵素 / 部位特異的変異 / 実験室内進化

研究概要

イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデルたんぱく質として、高度好熱菌Thermus thermophilusの生産する熱安定酵素常温菌の相当する酵素を比較解析することにより、酵素たんぱく質の構造の揺らぎと生理活性と立体構造の安定性の三者間の関係を解析することを目的として国際共同研究を行っている。まず、高度好熱菌の酵素の立体構造を詳細に解析した。さらに、高度好熱菌のイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子と常温菌の遺伝子を混ぜ合わせて、キメラ酵素を作った。キメラ酵素の熱物性を解析し、その立体構造を結晶学的手法により決定した。大腸菌の酵素については日米共同研究で進め、熱物性の解析を進めた。一方では、分子設計によりキメラ酵素の耐熱化を図り、部位特異的変異によりアミノ酸残基の変換を行い安定化に成功した。変異酵素の立体構造も決定した。
日米は協力して、熱安定だが常温で比活性の低い高度好熱菌酵素の常温への適応進化を試みた。すなわち、好熱菌イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を大腸菌の同酵素の完全欠損株に導入し、連続培養により常温に適応するようになった株を選抜した。遺伝子構造を解析すると、酵素の構造遺伝子部分位変異はなく、上流部分の脱落が見られた。遺伝子解析の結果、これは酵素構造遺伝子の翻訳能率を上げる変異であることが分かった。この結果に基づいて、日米は分担してそれぞれシングルコピー数のプラスミドを用いる系と大腸菌染色体内への組み込み系を開発中である。この系が完成すると、常温での比活性の高い変異酵素たんぱく質が得られる予定である。

研究成果

• [文献書誌] T.OSHIMA,K.NUMATA,Y.HAYASHI,H.KIRINO,A.YAMAGISHI,T.WAKAGI他: "Stabilization of enzyme proteins:A case study using 3-isopropylmalate dehydrogenase" Protein Eng. 6(8). 1003 (1993)
• [文献書誌] S.AKANUMA A.YAMAGISHI T.OSHIMA: "Thermostabilization of chimeric 3-isopropylmalate dehydrogenase by random mutagene is" Protein Eng. 6(8). 1011-1012 (1993)
• [文献書誌] K.MIYAZAKI T.OSHIMA: "Tyrosine-139 in Termus termophilus 3-isopropylmalate dehydrogenase is involved in catalytic function" FEBS Letters. 332. 37-38 (1993)
• [文献書誌] K.MIYAZAKI K.KAKINUMA H.TERASAWA T.OSHIMA: "Kinetic analysis on the substrate specificity of 3-isopropylmalate dehydrogenase" FEBS Letters. 332. 35-36 (1993)
• [文献書誌] S.KONDO,T.OSHIMA,A.YAMAGISHI: "A Physical Map of the Sulfur-Dependent Archaebacterium,Sulfolobus acidocaldarius 7 chromosome" J.Bacteriol. 175. 1532-1536 (1993)
• [文献書誌] T.TAKADA,S.AKANUMA,T.KOTSUKA,M.TAMAKOSHI,A.YAMAGISHI,T.OSHIMA: "Recombination deficient mutants isolated from an extreme thermophile,Thermus thermophilus" Appl.Environ.Microbiol. 59. 2737-2739 (1993)