好熱菌蛋白質の熱安定化機構の熱力学的解明

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04044109
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 油谷 克英 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教授 (90089889)
• 研究分担者: PETER L Priv ジョーンズポプキンス大学, 生物カロリメーターセンター, 教授 ; 上平 初穂 通産省, 生命工学工業技術研究所, 室長 ; 杉野 義信 関西医科大学, 教養部, 教授 (00028177)
• キーワード: 好熱菌酵素 / 耐熱性蛋白質 / カロリメーター / 蛋白質の安定性 / トリプトファンシンターゼ / 熱力学的パラメーター / 変性のエンタルピー / 変性のエントロピー

研究概要

本研究課題の内、我が方が担当している研究は、好熱菌蛋白質の耐熱化の原因と考える因子を常温菌蛋白質でその因子がどの様に働くかを変異蛋白質を用いて確認することである。今年度得られた結果の内、特徴的なものを列挙する。(1)トリプトファン合成酵素αサブユニットのα-ヘリックスに存在する残基のいくつかの変異型の内、P261A変異型のみが安定性を著しく向上させた。一般にプロリンからアラニンへの置換は変性状態のエントロピーを増加させ、蛋白質を不安定化させる。しかし、ヘリックス内ではプロリンはヘリックス構造の破壊残基で、アラニンはヘリックス形成能の高い残基である。互いに相矛盾する性質を兼ね備えた残基であったので、特に興味がもたれた。結果は安定性(変性温度)が著しく高くなったが、変性のエンタルピー変化は野生型とほとんど変わらなかった。このことは、期待に反して変性のエントロピー変化が減少していることを示す。これは、残基の特性から類推される方向とは矛盾し、置換により変性状態またはNative状態の構造が変化に起因しているとと考えられる。(2)好熱菌蛋白質の熱安定化の機構として、分子内部の残基の疎水性を高める方法がある。同αサブユニットは3個のシステイン残基が存在し、いずれも分子内部に位置している。そこでこれらの残基を、セリン、アラニン、バリンに置換した変異型を作製し、安定性をカロリメータを用いて熱力学的に解析した。セリン置換型では安定性の低下した変異型が、アラニン、バリン変異型では安定性を向上させた変異型がみられたが見られたがその程度は種々であった。このことは、期待通り分子内部の疎水性を高くすると安定性の向上につながることを示すしたが、全ての部位で一様には変化しなかった。つまり、いずれもが分子内部に埋もれている残基であったが、その残基の置かれた構造上の特徴に左右されること示している。

研究成果

• [文献書誌] Kyoko OGASAHARA, Kaori HIRAGA, Wataru ITO, Edith W.Miles, and Katsuhide YUTANI: "Origin of the Mutual Activation of the α and β_2 Subunits in the α2β_2 Complex of Tryptophan Synthase: Effect of Alanine or Glycine Substitutions at Proline Residues in the α Subunit" J. Biol. Chem.267. 5222-5228 (1992)
• [文献書誌] Katsuhide YUTANI, Kyoko OGASAHARA, and Kunihiro KUWAJIMA: "The Absence of the Thermal Transition in Apo-α-Lactalbumin in the Molten Globule State: A Study by Differential Scanning Mirocalorimetry." J. Mol. Biol.228. 347-350 (1992)
• [文献書誌] Thierry Hering, Katsuhide YUTANI, Koji INAKA, Ryota KUROKI, Masaaki MATSUSHIMA, and Masakazu KIKUCHI: "Role of Proline Residues in Human Lysozyme Stability: A Scanning Calorimetric Study Combined with X-ray Structure Analysis of Proline Mutants" Biocmeistry. 31. 7077-7085 (1992)
• [文献書誌] Yoshio TANIYAMA, Kyoko OGASAHARA, Katsuhide YUTANI, and Masakazu KIKUCHI: "Folding Mechanism of Mutant Human Lysozyme C77/95A with Increased Secretion Efficiency in Yeast." J Biol. Chem.267. 4619-4624 (1992)
• [文献書誌] Ryota KUROKI, Shigetugu KAWAKITA, Haruki NAKAMURA, and Katsuhide YUTANI: "Entropic Stabilization of a Mutant Lysozyme (D86/92) Induced by Calcium Binding" Proc. Natl. Acad. Sci USA. 89. 6803-6807 (1992)
• [文献書誌] Ryota KUROKI, Katsutoshi NITTA, and Katsuhide YUTANI: "Thermodynamic Changes in the Binding of Ca to a Mutant Human Lysozyme (D86/92): Enthalpy-enthropy Compensation Obseved upon Ca Binding to Proteins" J. Biol. Chem.267. 24297-24301 (1992)