神経細胞・細胞骨格の分子細胞生物学的研究

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04102005
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 廣川 信隆 東京大学, 医学部(医), 教授 (20010085)
• 研究分担者: 竹村 玲子 冲中記念成人病研究所, 研究員 (50171674) ; 吉武 玲子 東京大学, 医学部(医), 助手 (40230718) ; 金井 克光 東京大学, 医学部(医), 助手 (80214427) ; 中田 隆夫 東京大学, 医学部(医), 講師 (50218004)
• キーワード: 神経細胞 / 細胞骨格 / 形態形成 / 物質輸送 / 微小管関連蛋白 / タウ / KIFs / MAP2

研究概要

1)神経細胞の形態形成と細胞骨格
(1)本年はinvivoでの主要なMAPsの機能を解析するため、まずTauの遺伝子欠失マウスをHomologous Recombination法で作りその解析を行なった。面白いことに中枢神経系に大きな組織学上の異常は認められなかったがTauを多く発現する小脳顆粒細胞軸索などの細い径の軸索では微小管の数が減少し微小管間の架橋構造が減少し、軸索内の微小管Organizationと安定性に大きな変化がある事が判明した。また面白いことにMAP1Aの合成が代償性に上昇している事も分かった。この結果から軸索伸長に対するTauの機能は、MAP2CとRedundantであるかMAP1Aにより代償されたと考えられ、MAPsの形態形成上での機能は多種類のMAPにより2重、3重に保証されている事が推測される。(2)軸索内及び樹状突起内では、微小管とニュ-ロフィラメントが平行に配列し、その間に架橋構造が発達している。この微小管とニュ-ロフィラメントの相関は、軸索及び樹状突起形成の重要なcore構造を作る基盤となっている。今回私達は再構成系を中心とした解析により、微小管とニュ-ロフィラメントがニュ-ロフィラメントH蛋白(NF-H)のC末Tail部分により架橋されており、この架橋がNF-H C末のTauキナ-ゼによるリン酸化ではずれ、脱リン酸化により形成される事を示す結果を得、リン酸化が微小管とニュ-ロフィラメントの相関に重要な機能を果たしている事を示した。
2)物質輸送
(1)神経軸索内では、ミトコンドリア、シナプス小胞の前駆体、軸索形質膜の前駆体、エンドゾ-ム、多胞体等の機能の異なった小器官が順行性および逆行性に異なった速度で送られている。また遅い輸送ではおもに細胞骨格蛋白が送られているが、このモ-タ-は全く分かっていない。この複雑であるが実によく統制された物質輸送は神経細胞の形態形成および機能発現にとり基本的に重要である。その機構を明らかにするため、私達は既知のキネシンと脳ダイニン以外の新しいモ-タ-分子があると考えそれらを分子生物学的に探索し、KIF1A,KIF1B,KIF2,KIF3A,KIF3B,KIF4,KIF5の新しい7種類の微小管に結合し、しかもATPase活性のあるモ-タ-分子の候補の遺伝子のクロ-ニングと一次構造の決定を行なった。今年度はこのうち特に、KIF3A,KIF3BとKIF4の解析を行い、バキュロウイルス、Sf9細胞系を用いたin vitroでの蛋白精製、Motilityのassay、抗体産生およびそれを用いた免疫細胞化学、結紮する事により順行性、逆行性の輸送を止めた軸索の免疫染色などによりKIF3AとKIF3Bがヘテロダイマ-を作りキネシン以外の新しい順行性の膜輸送のためのモ-タ-分子(0.6μm/sec)として、働くこと、またKIF4が幼若な神経特異に膜小器官の(Growth cone内の膜小器官等)を輸送する順行性の速度の遅い(0.2μm/sec)モ-タ-分子である事を明かにした。
(2)逆行性モ-タ-分子の候補である脳ダイニン重鎖510KDの遺伝子のクロ-ニングと一次構造の決定(4644アミノ酸)を行なった。分子の中央部にATP結合部位が4つあり、ベン毛ダイニンとの構造比較により中央部とC末に微小管結合領域とATPase活性部位があり、N末が膜小器官に結合する部位であることが示唆された。(3)微小管関連蛋白は、神経細胞の形態形成にかかわりモ-タ-分子は、微小管上を滑って物質を輸送する。この二種の異なった分子の微小管との結合部位の相関を解析した。MAP2、Tauおよびdeletion mutant cDNAによりin vitroで作ったそれらの微小管結合ドメインとキネシン、脳ダイニンの微小管との結合の競合実験を行なったところ、このモ-タ-分子とMAPsが微小管上での結合部位を競合している事が分かり、モ-タ-分子は、MAPs結合部位を巧妙にすり抜けて物質輸送を行なっている事が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Takemura,R.: "Reorganization of brain spectrin(fodrin)during differentiation of PC12 cells." Neuroscience. 52. 381-391 (1993)
• [文献書誌] Umeyama,T.: "Dynamics of microtubules bundled by microtubule associated protein 2 C(MAP2)." Journal of Cell Biology. 120. 451-465 (1993)
• [文献書誌] Okabe,S.: "Do photobleached fluorescent microtubules move ?:Reevaluation of fluorescence laser photobleaching both in vitro and in growing Xenopus axon." Journal of Cell Biology. 120. 1177-1186 (1993)
• [文献書誌] Okabe,S.: "Dynamics of the neuronal intermediate filaments." Journal of Cell Biology. 121. 375-386 (1993)
• [文献書誌] Nakata,T.: "A novel member of dynamin-family of GTP-binding protein is expressed specifically to testis." Journal of Cell Science. 105. 1-5 (1993)
• [文献書誌] Noda,Y.: "Localization of dynamin:Widespread distribution in neurons and association with membraneous organelles transported anterogradely." Neuroscience. 55. 113-127 (1993)
• [文献書誌] Zhang,Z.: "The primary structure of rat brain dynein heavy chain,a cytoplasmic motor enzyme." Proceeding of the National Academy of Science of the USA. 90. 7928-7932 (1993)
• [文献書誌] Hirokawa,N.: "Axonal transport and the cytoskeleton." Current Opinion in Neurobiology.3. 724-731 (1993)
• [文献書誌] Hirokawa,N.: "Mechanism of axonal transport.Identification of new molecular motors and regulations of transports." Neuroscience Research. 18. 1-9 (1993)
• [文献書誌] Miyasaka,H.: "Interaction of the tail domain of high molecular weight subunits of neurofilaments with the C-terminal region of tubulin and its regulation by tau protein kinase II." Journal of Biological Chemistry. 268. 22695-22702 (1993)
• [文献書誌] Nakata,T.: "Thermal Drift is enough to drive microtubules in the absense of motor proteins." Biophysical Journal. 65. 2504-2510 (1993)
• [文献書誌] Hirokawa,N.: "Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins." Current Opinion in Cell Biology. 6. 74-82 (1994)
• [文献書誌] Harada,A.: "Tau is not essential for polarized neuronal cell morphogenesis but important for microtubule organization and stabilization in small caliber axons." Nature. (in press). (1994)
• [文献書誌] Hagiwara,H.: "Interaction between cytoplasmic dynein and tau or MAP2 for the binding to microtubules." Journal of Biological Chemistry. 269. 3581-3589 (1994)