微量蛋白質の末端配列決定法、特に新しいカルボキシ末端配列の決定法の確立

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04102008
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 次田 晧 東京理科大学, 総合研究所, 教授 (00028284)
• 研究分担者: 加茂 政晴 東京理科大学, 総合研究所, 助手 (40214564)
• キーワード: C末端配列分析法 / N末端高感度分析法 / N末端修飾基除去法 / FAB、ESI質量分析 / ECDガスクロマト / フッ化有機酸 / フッ化有機酸無水物 / ヒドラジン

研究概要

1.C末端配列;(1)気相高濃度有機酸を用いる方法は完成し学術雑誌に発表した。この方法ではセリンのN末端、アスパラギン酸のC末端でペプチド鎖の切断が起こる欠点があるが数段のC末端からの逐次分解が再現性よく見られる。(2)気相有機酸酸無水物を用いる方法では-18℃10分間という非常に緩和な条件で反応が進む。この方法は(1)に比べて分解段数が10〜20段と多い。現在全てのアミノ酸の組み合わせのペプチド鎖に分解が有効であるが、この反応の機構は、再現性は、広く用いられるための装置化、大きな蛋白質への適用等について検討を進めている。二つの速報を発表した。これらの分析法の中心となる質量分析器にESIイオン源を導入し、試料の微量化、高分子量の測定条件について試験を繰り返している。2.N末端微量配列分析;通常のエドマン分解法の中間産物ATZアミノ酸に気相多弗化アルギルアミンで高感度化しECD検出器を備えたガスクロマトで10f迄検出可能な道を開いた。この方法は速報誌により発表した。親水性アミノ酸の検出がガスクロマトで感度不良なことを見つけて種々工夫をこらしている。3.ブロックされたN末端のデブロック法を全く新しくヒトラジンガスを用いる事で成功した。ホルミル基は-5℃でピログルタミル基は常温で各々数時間で行える事を見い出し、速報と詳報により発表した。4.2D電気泳動を用いた蛋白質の分離とそれに次ぐアミノ酸配列分析:2D電気泳動を標準化する努力を国内、国際共に行い、標準化のための標準蛋白質の設定、データベースフォーマットを発表し本年三月にも国際ワークショップをドイツで行う。イネの10の組織から三千ヶの蛋白スポットを取り出し、その120ヶについて配列分析した。1-(1)と3はほぼ完成し速報・詳報共に終了。1-(2)については蛋白質の少量でどうC末端配列を行うか、4の電気泳動のスポットからの抽出、SDS除去-質量分析と研究を続ける。2も研究を続けて実用化に結ぶ。

研究成果

• [文献書誌] A.Tsugita: "C-Terminal sequencing of Protein;A novel partial acid hydrolysis and analysis by mass spectrometry" Eru.J.Biochem.206. 691-696 (1992)
• [文献書誌] A.Tsugita: "Reaction of pentafluoropropionic anhydride vapor on polypeptide as revealed by mass spectrometry,A carboxypeptidase mimetic degradation" Chem.Letters. 1992. 235-238 (1992)
• [文献書誌] A.Tsugita: "Development of a new method for C-terminal sequence analysis" J.Protein Chem.11. 362-363 (1992)
• [文献書誌] K.Takamoto: "Application of new C-terminal sequencing method of proteins" J.Protein Chem.11. 363-364 (1992)
• [文献書誌] C.S.Jone: "Sensitization of Edman amino acid derivatives using the electron capture sensitive reagent,1-trifluoro-2-aminoethane" Chem.Letters. 1992. 929-932 (1992)
• [文献書誌] A.Tsugita: "New technique for analysis of amino acid sequence" New Tech.& Products. 20. 43 (1992)
• [文献書誌] 次田 晧: "タンパク質のC末端からのアミノ酸配列分析法" バイオインダストリー. 9. 359-366 (1992)
• [文献書誌] 次田 晧: "アミノ酸配列の新分析法" 臨床検査. 36. 779-781 (1992)
• [文献書誌] 次田 晧: "アミノ酸配列の新しい決定法" 化学と工業. 45. 2049-2051 (1992)
• [文献書誌] 次田 晧: "ペプチドC末端の新しい配列決定法" バイオサイエンスとインダストリー. 50. 22-25 (1992)
• [文献書誌] M.Kamo: "Sensitization of Edman amino acid derivatives using electron capture sensitive reagent,1-trifluoro-2-aminoethane" J.Protein Chem.11. 358-359 (1992)
• [文献書誌] N.Miyatake: "Hydrazine deblocking method for formyl- and pyroglutamyl residues from N-terminal of protein" J.Protein Chem.11. 366-367 (1992)
• [文献書誌] K.Satake: "Partial hydrazinolysis of protein at the asparaginyl linkage" J.Protein Chem.11. 366-367 (1992)
• [文献書誌] R.Simpson: "Workshop on two-dimensional gel protein databases" Electrophoresis. 13. 1055-1061 (1992)
• [文献書誌] H.Okazaki: "A two dimensional gel electrophoresis database and its standarization" CODATA Bull.24. 72-73 (1992)
• [文献書誌] M.Ikekita: "Purification of the major cationic kallikrein inhibitor from bovine pituitary gland" Protein Sequence Data Anal.5. 7-11 (1992)
• [文献書誌] T.Morita: "Synaptocanalin I,a protein associated with brain ω-conotoxin-sensitive calcium channels" Biomedical Research. 13. 357-364 (1992)
• [文献書誌] N.Onishi: "Canine pancreatic kallikrein;enzyme isolation and characterizatin" Protein Sequence Date Anal.5. 1-5 (1992)
• [文献書誌] Y.B.Yang: "Characterization of D-aminoacylase from Alaliqenes denitrificans DA181" Biosci.Biotech.Biochem.56. 1392-1395 (1992)
• [文献書誌] H.Iwadate: "Structure of spinach ferredoxin-thioredoxin reductase" Photosynthesis Research. 34. 155 (1992)
• [文献書誌] K.Nakazato: "The carboxyl-terminal half-molecule of ovotransferin prepared by selective digestion of the amino-terminal lobe with thermolysin" Biosci.Biotech.Biochem.56. 71-75 (1992)
• [文献書誌] K.Nakazato: "Preparation of amino-terminal half-molecule of ovotransferin by trptic digestion of intact molecule selectivity standard with Al(III)at the N-lobe" Biosci.Biotech.Biochem.56. 687-688 (1992)
• [文献書誌] F.Fukai: "Two antipodad actions of fibronection of the differentiation of ST-13 preadipocytes" J.Biol.Chem.(1993)
• [文献書誌] N.Miyatake: "Removal of N-terminal formyl groups and deblocking of pyrrolidone carboxylic acid of proteins with anhydrous hydrazine vapor" Eur.J.Biochem.(1993)