1992 年度実績報告書

X線損傷DNAの修復開始に関与していると推定されるヒト細胞修復酵素の研究

研究課題

研究課題/領域番号	04152081
研究機関	岡山大学
研究代表者	関周司岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)
研究分担者	秋山公祐岡山大学, 医学部, 助手 (30222540) 渡辺晰子岡山大学, 医学部, 助手 (30093719)
キーワード	DNA修復酵素 / X線損傷DNA / APエンドヌクレアーゼ / APEXヌクレアーゼ / cDNAクローニング / 除去修復酵素 / ヒト細胞 / ドメイン構造
研究概要	X線等放射線や活性酸素によって生じるDNAの一本鎖切断および多くの要因で生じるDNA塩基欠失部位(AP sites)の修復開始に関与すると推定される多機能DNA修復酵素(APEX nucleaseと命名;分子量35.4kDa)の性状を検討した。1.前年度クローニングしたヒト本酵素cDNAのタンパク質コード領域を挿入した発現プラスミドを構築し、これでexonuclease III(APEX nucleaseはこのexo IIIのホモローグ)欠損大腸菌株細胞を形質転換した。形成転換細胞は、親株細胞に比し、AP sitesを生じる薬剤および一本鎖切断を生じる薬剤に抵抗性を示し、本酵素が予想通りの生理活性を持つことを示した。2.本酵素一次構造のホモロジー比較から、核局在シグナルをもつ6kDaのN末領域とexo III等とホモロジーを示す29kDaのC末領域(活性ドメイン)から成ることが示唆された。本酵素精製の過程で、35kDa、33kDaおよび31kDaの活性な酵素断片が生じた。前2つの断片はsubtilisin様のプロテアーゼで、31kDaの断片は化学的機構でN末アミノ酸の一部が除かれて生じることが判明した。これらの結果は推定ドメイン構造を支持した。3.測定した全ての細胞に本酵素は存在しており、house keeping enzymeと考えられた。X線照射や薬剤処理でHeLa細胞に本酵素の誘導を試みたが、誘導されなかった。4.ヒトの白血球ゲノムライブラリーから本酵素遺伝子をクローニングし、塩基配列をきめた。本遺伝子は、2.64kbで5つのエキソンから構成されていた。5.今後、発がんと本酵素との関係を研究するためにはアンチセンスRNAの発現により本酵素量を低下させたり、本酵素遺伝子を破壊してみる必要があると考えられた。また、本酵素が関与するDNA修復系を一体として研究するため、本酵素の次のステップに関与する酵素dRpaseも研究する必要があるとの結論を得た。現在これらの研究を開始している。

研究成果
(9件)

すべてその他

すべて文献書誌 (9件)

[文献書誌] Seki,Shuji: "cDNA cloning,sequencing expression and possible domain structure of human APEX nuclease homologous to Escherichia coli exonuclease III." Biochim.Biophys.Acta. 1131(3). 287-299 (1992)
[文献書誌] Zhang.Bo: "Detection and analyses by gel electrophoresis of cisplatinmediated DNA." Acta Med.Okayama. 46(6). 427-434 (1992)
[文献書誌] Seki,Shuji: "A possible cause of heterogeneity of mammalian apurinic/apyrimidinic endonuclease." Int.J.Biochem.25(1). 53-59 (1993)
[文献書誌] Seki,Shuji: "Activity gel and activity blotting methods for detecting DNA-modifyin (repair) enzymes." J.Chromatogr.(1993)
[文献書誌] Seki,Shuji: "Inhibition of cisplatin-mediated DNA damage in vitro by ribonucleotides." Jpn.J.Cancer Res.(1993)
[文献書誌] Ono,Yasuhiro: "Expression of a putapative catalytic domain of human APEX nuclease (a major apurinic/apyrimidinic endonuclease) in Escherichia coli." Int.J.Biochem.25. (1993)
[文献書誌] Tsutsui,Kimiko: "Differential expression of DNA topoisomerase II isozymes in developing rat brain." Molecular Biology of DNA Topoisomerases and its Application to Chemotherapy,T.Andoh,H.Ikeda and M.Oguro,eds,CRC Press,Boca Raton,Ann Arbor,London and Tokyo. 115-120 (1993)
[文献書誌] 渡辺晰子: "哺乳類細胞APエンドヌクレアーゼ多様性の一因" 生化学. 64(8). 836-836 (1992)
[文献書誌] 秋山公祐: "哺乳類細胞多機能DNA修復酵素APEXヌクレアーゼのドメイン構造と遺伝子" 第15回日本分子生物学会年会講演要旨集. 363-363 (1992)

1992 年度 実績報告書

X線損傷DNAの修復開始に関与していると推定されるヒト細胞修復酵素の研究

研究代表者

関 周司 岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)

研究成果

[文献書誌] Seki,Shuji: "cDNA cloning,sequencing expression and possible domain structure of human APEX nuclease homologous to Escherichia coli exonuclease III." Biochim.Biophys.Acta. 1131(3). 287-299 (1992)

[文献書誌] Zhang.Bo: "Detection and analyses by gel electrophoresis of cisplatinmediated DNA." Acta Med.Okayama. 46(6). 427-434 (1992)

[文献書誌] Seki,Shuji: "A possible cause of heterogeneity of mammalian apurinic/apyrimidinic endonuclease." Int.J.Biochem.25(1). 53-59 (1993)

[文献書誌] Seki,Shuji: "Activity gel and activity blotting methods for detecting DNA-modifyin (repair) enzymes." J.Chromatogr.(1993)

[文献書誌] Seki,Shuji: "Inhibition of cisplatin-mediated DNA damage in vitro by ribonucleotides." Jpn.J.Cancer Res.(1993)

[文献書誌] Ono,Yasuhiro: "Expression of a putapative catalytic domain of human APEX nuclease (a major apurinic/apyrimidinic endonuclease) in Escherichia coli." Int.J.Biochem.25. (1993)

[文献書誌] Tsutsui,Kimiko: "Differential expression of DNA topoisomerase II isozymes in developing rat brain." Molecular Biology of DNA Topoisomerases and its Application to Chemotherapy,T.Andoh,H.Ikeda and M.Oguro,eds,CRC Press,Boca Raton,Ann Arbor,London and Tokyo. 115-120 (1993)

[文献書誌] 渡辺 晰子: "哺乳類細胞APエンドヌクレアーゼ多様性の一因" 生化学. 64(8). 836-836 (1992)

[文献書誌] 秋山 公祐: "哺乳類細胞多機能DNA修復酵素APEXヌクレアーゼのドメイン構造と遺伝子" 第15回日本分子生物学会年会講演要旨集. 363-363 (1992)

1992 年度実績報告書

関周司岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)

[文献書誌] 渡辺晰子: "哺乳類細胞APエンドヌクレアーゼ多様性の一因" 生化学. 64(8). 836-836 (1992)

[文献書誌] 秋山公祐: "哺乳類細胞多機能DNA修復酵素APEXヌクレアーゼのドメイン構造と遺伝子" 第15回日本分子生物学会年会講演要旨集. 363-363 (1992)