1992 年度実績報告書

蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

研究課題

研究課題/領域番号	04220225
研究機関	大阪大学
研究代表者	長谷純宏大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)
キーワード	HPLC / 蛍光標識 / ピリジアルアミノ化 / マンノシダーゼ / 酵素 / ニワトリ
研究概要	水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネーション)と糖鎖講造で分かれる HPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。本研究は糖鎖の活性発現の解析の第一歩として、複雑な構造の糖鎖を用い、ウズラおよびニワトリ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼの基質特異性を高精度で解析する事が目的である。前年度迄に、ウズラ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼについて、精製と基質特異性を調べた。本年度はニワトリ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼについて同様の研究を計画した。ニワトリの輸卵管をホモジナイザーを用いてすりつぶし、30,000xg上澄を粗酵素標品中にある、p-nitrophenyl α-mannopyranoside等の簡単な構造の基質では検出されない、ウズラと同様の高度の基質特異性を持ったコバルト依存性α-マンノシダーゼの検索を行なった。このために、酵素活性の測定は初年度調製したMan_5 GlcNAc_2-PAやMan_9 GlcNAc_2-PAを基質として用い酵素反応後、生成物をサイズフラクショネーションHPLCと蛍光検出器を用いて定量した。粗酵素標品より、0-30%硫安塩析、DEAE、オクチルセファロース、セファアクリルS-300、MonoQ、ハイドロキシアパタイトの各クロマトグラフィーを行って現在精製中である。これで精製が完了すると基質特異性が解析できる。

研究成果

(8件)

すべてその他

すべて文献書誌 (8件)

[文献書誌] N.Kuraya: "Release of O-Linked Sugar Chains from Glycoproteins with Anhydrous Hydrazine and Pyridylamination of the Sugar Chains with Improved Reaction Condieions" J.Biochem.112. 122-126 (1992)
[文献書誌] S.Hase: "Conversion of Pyridylamino Sugar Chains to l-Amino-l-Deoxy Derivatives,Intermediates for Tagging with Fluorescein and Biotin" J.Biochem.112. 266-268 (1992)
[文献書誌] S.Hase: "Improved Method for the Compont Sugar Analysis of Glycoprotins by Pyridylamino Sugars Purified with Immobilized Boronic Acid" Biosci.Biotech Biochem.56. 1676-1677 (1992)
[文献書誌] K.Fukase: "Synthesis of New Serine-Linked Oligosaccharides in Blood-Clotting Factors VII and IX and Protein Z." Bull.Chem.soc.Jpn.65. 436-445 (1992)
[文献書誌] J.Suzuki: "Assay of Urinary Free Fucose by Fluorescence Labeling and High-Performance Liquid Chromatography" Clin.Chem.38. 752-755 (1992)
[文献書誌] H.Nishimura: "Human Factor IX Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine 61 through the Fucose Residue" J.Biol.Chem.267. 17520-17525 (1992)
[文献書誌] 長谷純宏: "複合糖質ピリジルアミノ化糖鎖とその応用,蛋白質核酸酵絵、37" 共立出版, 6 (1992)
[文献書誌] 長束俊治: "糖-その多様性を探る(化学増刊122)ピリジルアミノ化法による糖鎖の高感度分析" 化学同人, 8 (1992)

1992 年度 実績報告書

蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

研究代表者

長谷 純宏 大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)

研究成果

[文献書誌] N.Kuraya: "Release of O-Linked Sugar Chains from Glycoproteins with Anhydrous Hydrazine and Pyridylamination of the Sugar Chains with Improved Reaction Condieions" J.Biochem.112. 122-126 (1992)

[文献書誌] S.Hase: "Conversion of Pyridylamino Sugar Chains to l-Amino-l-Deoxy Derivatives,Intermediates for Tagging with Fluorescein and Biotin" J.Biochem.112. 266-268 (1992)

[文献書誌] S.Hase: "Improved Method for the Compont Sugar Analysis of Glycoprotins by Pyridylamino Sugars Purified with Immobilized Boronic Acid" Biosci.Biotech Biochem.56. 1676-1677 (1992)

[文献書誌] K.Fukase: "Synthesis of New Serine-Linked Oligosaccharides in Blood-Clotting Factors VII and IX and Protein Z." Bull.Chem.soc.Jpn.65. 436-445 (1992)

[文献書誌] J.Suzuki: "Assay of Urinary Free Fucose by Fluorescence Labeling and High-Performance Liquid Chromatography" Clin.Chem.38. 752-755 (1992)

[文献書誌] H.Nishimura: "Human Factor IX Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine 61 through the Fucose Residue" J.Biol.Chem.267. 17520-17525 (1992)

[文献書誌] 長谷 純宏: "複合糖質ピリジルアミノ化糖鎖とその応用,蛋白質核酸酵絵、37" 共立出版, 6 (1992)

[文献書誌] 長束 俊治: "糖-その多様性を探る(化学増刊122)ピリジルアミノ化法による糖鎖の高感度分析" 化学同人, 8 (1992)

1992 年度実績報告書

長谷純宏大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)

[文献書誌] 長谷純宏: "複合糖質ピリジルアミノ化糖鎖とその応用,蛋白質核酸酵絵、37" 共立出版, 6 (1992)

[文献書誌] 長束俊治: "糖-その多様性を探る(化学増刊122)ピリジルアミノ化法による糖鎖の高感度分析" 化学同人, 8 (1992)