1992 年度実績報告書

金属プロテアーゼの構造と触媒機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号	04225226
研究機関	九州大学
研究代表者	岩永貞昭九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
研究分担者	川畑俊一郎九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
キーワード	金属プロテアーゼ / 合成ペプチド基質 / クサリ蛇毒 / 出血因子 / 血栓性因子 / サーモライシン / 一次構造 / エンドプロテアーゼ
研究概要	本研究では、本属プロテアーゼの中で比較的精製が容易で、かつ大量に分離が可能な蛇毒亜鉛プロテアーゼをとりあげ、このエンドプロテアーゼの構造と觸媒活性基を明らかにすることを目的としている。具体的には、このプロテアーゼの基質と阻害剤を開発し、活性部位残基を同定し、結晶のX線回析による立体構造の解明を通して、酵素活性部位のミクロ環境を明白にする。本年度は、主に基質の開発に焦点を絞って進めた。ハブ毒の出血性、非出血性の金属プロテアーゼ及びPussell's viper毒の凝固X因子活性化酵素(RVV-X)は、サーモライシンや哺乳類コラゲナーゼなどとは一次構造上相同性などのアミノ酸配列をペプチド領域内にもつ分子内蛍光消光基質(蛍光基にアミノベンゾイル基(Abz)、消光基にジニトロベンジルアミド基(Dna)をもつ)を10年合成し、その有用性を検討した。その結果、これらペプチド合成基質を用いた蛇毒金属プロテアーゼの高感度かつ簡便なアッセイ法を確立できた。フィブリノーゲン切断部位周渡配列を含むAbz-Ser-Pro-Met-Leu-Dnaは、ハブ毒出血因子(HR1A及びHR2a)によっても最も高いkcat/km値で切断されたが(切断部位はPro-Met)、サーモライシンはこの基質に対して、約1/30の活性しか示しなかった。マムシ科・クサリヘビ科の蛇の粗毒(7種)もこの基質を強く水解し、この活性はEDTAによって完全に阻害された。一方、RVV-XはP_1位にArgを好み、Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Leu-Dnaを最も良く水解した。また、今回開発した高感度アッセイ法により蛇毒金属プロテアーゼとサーモラシインの間、さらに出血因子とRVV-Xとの間に明白な基質特異性の差のあることが明らかとなった。

研究成果

(8件)

すべてその他

すべて文献書誌 (8件)

[文献書誌] Yoshiki Miura: "Preparation and Properties of Monoclonal Antibodies against Lipopolysaccharide-Sensitive Serine Protease Zymogen,Factor C,form Horseshose Crab (Tachypleustridentatus)Hemocytes." J.Biochem.112. 476-481 (1992)
[文献書誌] Shouiche Higashi: "Tissue Factou Poteintiates the Factor VIIa-catalyzed Hydrolysis of an Ester Substrate." J.Biol.Chem. 267. 179990-17996 (1992)
[文献書誌] Hitoshi Nishimuta: "Human Factor X Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine-61 through the Fucose Residue." 267. 17520-17525 (1992)
[文献書誌] Yoshekatsu Shigematsu: "Expression of Human Soluble Tissue factor in Yeast and Enzymatic Properties of Its Complex with Factor VIIa." 267. 21329-21337 (1992)
[文献書誌] Hiroyuki Takeya: "Coagulation Factor X Activating Enzyme from Russell's Viper Venom(RVV-X):A Novel Metalloproteinase wityDisintegrin (platelet aggregation inhibitor)-like and C-type Lectin-like Domains." 267. 14109-14117 (1992)
[文献書誌] Toshiyuki Miyata: "Prothrombin Salakta:Substitution of Glutamic Acid-466 by Alaine-redces the Fibrinogen Clotting Activity and the Estarase Activety." Biochemistry. 31. 2457-7462 (1992)
[文献書誌] 武谷浩之: "日本生化学会" 「生化学」ミニレヴュー64巻10号. 7 (1992)
[文献書誌] 東昌市: "中外医学社" Annual Review血液1992. 12 (1992)

1992 年度 実績報告書

金属プロテアーゼの構造と触媒機構の解析

研究代表者

岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)

研究成果

[文献書誌] Yoshiki Miura: "Preparation and Properties of Monoclonal Antibodies against Lipopolysaccharide-Sensitive Serine Protease Zymogen,Factor C,form Horseshose Crab (Tachypleustridentatus)Hemocytes." J.Biochem.112. 476-481 (1992)

[文献書誌] Shouiche Higashi: "Tissue Factou Poteintiates the Factor VIIa-catalyzed Hydrolysis of an Ester Substrate." J.Biol.Chem. 267. 179990-17996 (1992)

[文献書誌] Hitoshi Nishimuta: "Human Factor X Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine-61 through the Fucose Residue." 267. 17520-17525 (1992)

[文献書誌] Yoshekatsu Shigematsu: "Expression of Human Soluble Tissue factor in Yeast and Enzymatic Properties of Its Complex with Factor VIIa." 267. 21329-21337 (1992)

[文献書誌] Hiroyuki Takeya: "Coagulation Factor X Activating Enzyme from Russell's Viper Venom(RVV-X):A Novel Metalloproteinase wityDisintegrin (platelet aggregation inhibitor)-like and C-type Lectin-like Domains." 267. 14109-14117 (1992)

[文献書誌] Toshiyuki Miyata: "Prothrombin Salakta:Substitution of Glutamic Acid-466 by Alaine-redces the Fibrinogen Clotting Activity and the Estarase Activety." Biochemistry. 31. 2457-7462 (1992)

[文献書誌] 武谷 浩之: "日本生化学会" 「生化学」ミニレヴュー64巻10号. 7 (1992)

[文献書誌] 東 昌市: "中外医学社" Annual Review血液1992. 12 (1992)

1992 年度実績報告書

岩永貞昭九州大学, 理学部, 教授 (90029942)

[文献書誌] 武谷浩之: "日本生化学会" 「生化学」ミニレヴュー64巻10号. 7 (1992)

[文献書誌] 東昌市: "中外医学社" Annual Review血液1992. 12 (1992)