細胞増殖におけるプロテインキナーゼC群の機能の分子生物学的解析

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04253239
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 大野 茂男 横浜市立大学, 医学部, 教授 (10142027)
• 研究分担者: 秋田 朗子 東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報, 研究員 (40124432) ; 水野 恵子 横浜市立大学, 医学部, 助手 (90221803) ; 平井 秀一 横浜市立大学, 医学部, 助手 (80228759)
• キーワード: プロテインキナーゼC / PKC関連酵素 / ホルボールエステル / 転写活性化 / ジアシルグリセロール

研究概要

昨年度までに開発した系を用いて細胞内の各PKC分子種の活性化レベルを実際の応答反応で検討した。さらに、血清飢餓状態の3Y1細胞における種々の刺激に対するPKC分子群の細胞内動態を解析した。その結果、1)cPKC分子群はTPAに対し大きく応答し活性化するが、血清その他の生理的因子では活性化がほとんど認められなかった。2)nPKC分子群はTPAにも応答するが、血清刺激に対し大きく応答した。EGF、lyso phosphatidic acid(lyso PA)は血清と同様nPKCを活性化したがその効果は弱い。血清成分の何が効いているか不明である。一方、バキュロウィルスを用いた大量調製系で生成した酵素群を用いて、種々のリン脂質代謝産物の試験官内でのキナーゼ活性化能を検査し、lysoPAがTPA、DAGの活性化能を促進することを見いだしたが、これには分子群間の特異性は認められなかった。細胞内でのnPKC分子群特異的な活性化因子は不明である。3)aPKC分子群(我々が今年度新たに同定した新規分子種λを含む)はTPAには応答せず、血清により大きく活性化した。更にこの効果はEGF、TGFαによるものと考えられた。以上、細胞内でのPKC分子種の活性化を別々に検出する系を確立し、検討した結果、上記3種のPKC群が各々異なった経路で活性化されることが始めて示された。
一方、細胞内のPKC活性化を抑制するPKCの優性抑制変異を探索した。その結果、PKCδのキナーゼ欠質変異、制御ドメインの特定領域等の変異体が優性抑制効果を示すことを確認した。この効果は細胞内でTREの活性化に至るPKCの基質認識を阻害していることが想定された。分子種を識別する変異体の構築の可能性が示された。
これ以外にPKC分子種の発現の細胞特異性を調べ、nPKCδは精子細胞に、nPKCθは間質細胞に特異的に発現していることも見いだした。また、全分子種のキナーゼドメインの立体構造モデルを作成した。

研究成果

• [文献書誌] Hata,A.,Akita,Y.,Suzuki,S.and Ohno,S.: "Functional divergence of protein kinase C(PKC)family members;PKCγdiffers from PKC α,βII,and nPKC ε in its competence to mediate 12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate(TPA)-responsive transcriptional activation a TPA-response slsment." J.Biol.Chem.
• [文献書誌] Osada,S.,Hashimoto,Y.,Nomura.,S,Konnno.,Y.,Chida,K.,Tajima,O.,Kubo,K.,Akomoto,K.,Koizumo,H.,Kitamura,Y.,Suzuki,K.,Ohno.,S.and Kuroki,T.: "Predominant expression of novel protein kinase C η,aCa2+-independent isoform of protein kinse C in epithelial tissues,in association with epithlial differentiation." Cell Growth&Differentiation.
• [文献書誌] Kim,H-M.,Hirota,S.,Onore,H.,Hirata,T.,Suzuki,K.,Ohno,S.,Kuroki,T.,Kitamura,Y.and Nomura,S.: "Localization and development expression of a novel protein kinase C δ gene." Developmental Brain Research.
• [文献書誌] Osada,S.,Mizuno,K.,Saido,T.C.,Suzuki,K.,and Ohno,S.: "A new member of the protein kinase C family,nPKC θ,predominantly expressed in skeletal muscle." Molec.Cell.Biol.12. 3930-3938 (1992)
• [文献書誌] Maizcls,E.T.,Miller,J.B.,Cutler Jr.,R.E.,Jackiw,V.,Camey,E.M.,Mizuno,K.,Ohno,S.,and Hunzicker-Dunn,M.: "Estrogen modulates Ca2+-independent lipid-stimulated kinase in the rabbit corpus liteum of pseudopregnancy.Identification of lureal estrogen-modulated lipid-stimulated kinase as δ-C-kinase." J.Biol.Chem.267. 17061-17068 (1992)
• [文献書誌] Gruber,J.R.,Ohno,S.,and Niles,R.M.: "Increased expression of PKC α plays a key role in retinoic acid induced melanoma differentiation." J.Biol.Chem.267. 13356-13360 (1992)
• [文献書誌] Hata,A.,Ohno,S.,and Suzuki,K.: "Transcriptional activation of the gene for the large subunit of human m-calpain by 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate." FEBS Letters. 304. 241-244 (1992)
• [文献書誌] Niino,Y.,Ohno,S.and Suzuki,K.: "Positive and negative regulation of the transcription of the human protein Kinase C β gene." J.Biol.Chem.267. 6158-6163 (1992)
• [文献書誌] Saedo,T.C.,Mizuno,K.,Konno,Y.,Osada,S.,Ohno,S.and Suzuki,K.: "Purification and characterization of protein Kinase C ε(nPKC ε)from rabbit brain." Biochemistry. 31. 482-490 (1992)
• [文献書誌] 水野 恵子,大野 茂男: "プロテインキナーゼCアイソザイムの同定" 実験医学. 11(3). 163-169 (1993)
• [文献書誌] Ohno,S.: "Diversity and specificity of multiple protein kinase C." Progress in Endocrinology,Parthenon Press.,
• [文献書誌] 大野 茂男: "C-キナーゼとシグナル伝達" 腎臓学Key Notes,東京医学社, 2 (1992)