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原色素体には大量に含まれているが、葉緑体には検出されない分子量69kDの色素体DNA結合蛋白質の遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにすることが本研究の目的である。そのために、今年度はこの蛋白質の部分アミノ酸配列の決定を行った。
まず、タバコ培養細胞から原色素体核様体を大量に単離した後、低濃度の塩で洗いさらに高濃度の塩で処理することにより、比較的強固にDNAと結合している目的蛋白質を濃縮した。SDS-PAGEを行った後、目的バンドを含むゲルを切り出し、さらに電気泳動により、蛋白質をゲルから溶出するとともに濃縮した。クリーブランド法によりV8で部分的に消化して再び電気泳動し、SDSを0.02%含む緩衝液により、グラシーボンド膜に対してウエスタン・ブロットを行った。各ペプチドのバンドを切り出し、ペプチド・シークエンサー(Applied Biosystems、477A)によりN末端のアミノ酸配列を調べた。
その結果、V8プロテアーゼで処理すると、69kDの蛋白質がまず52kDと16kDに切断され、さらにこの52kDが14kDと38kDに切断されることが解った。69kDの蛋白質、および、52kD、38kD、16kDの各ペプチド断片について、N末端のアミノ酸配列を調べたところ、69kDのN末端は???-???-Thr-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Ala-Asn-Glu-Proであり、また52kDが同じ配列であったことから、この配列は間違いなく本蛋白質のN末端であると考えられる。38kDと16kDはそれぞれ独自の配列であった。
今後、この配列の基にDNAプローブを作製し、また、未同定の部分に関してはさらに大量の蛋白質を試料に用いてアミノ酸配列の決定を繰り返す予定である。
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