1992 年度実績報告書

好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

研究課題

研究課題/領域番号	04266218
研究機関	姫路工業大学
研究代表者	平田肇姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)
キーワード	アラニン能動輸送 / Na^+ / 大量発現 / 融合タンパン質
研究概要	好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42,500Daの単一ポリペプチドからなり、H^+あるいはNa^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるH^+(Na^+)/基質(アラニン、グリシン、セリン)シンポーターである。昨年までに我々はこの精製タンパク質から得たペプチド断片のアミノ酸配列の情報をもとにACPをコードする遺伝子のクローニングに成功した。本研究ではこのACP遺伝子のOREの全構造を決定し、さらに、太陽菌内での発現系の確立を目標とした。本年度の具体的成果は次の通りである。 1.これまでにACPのN末端に関する情報が得られていなかったのでinversePCRにより5'上流を決定したところ、156〜154の位置に終止コドン(TAA)が見いだされACP遺伝子のOREは1335塩基よりなることが判明した。 2.ACPのKyte-Doolittle法によるハイドロパシー解析から10〜12個の疎水性領域がみられ、さらに最低8本の膜貫通セグメントの存在が予測され、また、ホモロジー解析から南極の海洋細菌Alteromonas haloplanktisのNa^+依存性D-アラニン輸送体遺伝子(dagA)と高いホモロジーがみられた。 3.ACPの構造/機能連関を探るために大量発現系の確立は必須な過程である。まず、ACP遺伝子をT7プロモータに直接つなげる方法で大腸菌内での発現を試みたが不成功に終わった。そこでマルトース結合タンパク質遺伝子(MalE)との融合遺伝子を作製し大腸菌内で発現させたところ、IPTG添加によって全膜タンパク質の約15%に及ぶ量の分子量約85kDaのタンパク質が細胞膜画分に誘導発現された。これはマルトース結合タンパク質(分子量約43kDa)とACPの融合タンパク質と考えられる。現在この融合タンパク質から活性のあるACPの回収を試みている。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] Knmata,H.: "Primary Structure of the Alanine Carrier Protein of Thermophilic Bacetrium PS3." J.Biol.Chem.267. 21650-21655 (1992)
[文献書誌] Kamata,H.: "Partial Purification and Reconstitution of Inositol 1,4,5 Trisphosphate Receptor/Ca2+Channel of Bovine Liver Microsomes." J.Biochem.111. 546-552 (1992)
[文献書誌] Yamazaki,S.: "Expression of Human Metallothionein-II Fusion Protein in Eshirechia coli." Biochim.Intern.28. 451-460 (1992)
[文献書誌] Tsuda,M.: "Interaction of Rhodopsin,G-Protein and Kinase in Octopus Photoreceptors." Photochem.Photobiol.56. 1167-1172 (1992)
[文献書誌] Ando,K.: "Primary Struccture of Chitosanase Produced by Bacillus circulans MH-K1." J.Gen.Appl.Microbiol.38. 135-144 (1992)
[文献書誌] Yoshida,N.: "Characterization of an Abonermal Firinogen Osaka V with the Replacement of γ-Arhinine 375 by Glycine.The Lack of High Affinity Calcium Binding to D-Domains and the Lack of Protective Effect of Calcium of Fibrinolysis." J.Biol.Chem.267. 2753-2759 (1992)
[文献書誌] 平田肇: "日本生化学会編新生化学実験講座第6巻生体膜と膜輸送(上)第3章第5節平面膜へのFoF1-ATPaseの組込みと解析" 東京化学同人, 6 (1992)

1992 年度 実績報告書

好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

研究代表者

平田 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)

研究成果

[文献書誌] Knmata,H.: "Primary Structure of the Alanine Carrier Protein of Thermophilic Bacetrium PS3." J.Biol.Chem.267. 21650-21655 (1992)

[文献書誌] Kamata,H.: "Partial Purification and Reconstitution of Inositol 1,4,5 Trisphosphate Receptor/Ca2+Channel of Bovine Liver Microsomes." J.Biochem.111. 546-552 (1992)

[文献書誌] Yamazaki,S.: "Expression of Human Metallothionein-II Fusion Protein in Eshirechia coli." Biochim.Intern.28. 451-460 (1992)

[文献書誌] Tsuda,M.: "Interaction of Rhodopsin,G-Protein and Kinase in Octopus Photoreceptors." Photochem.Photobiol.56. 1167-1172 (1992)

[文献書誌] Ando,K.: "Primary Struccture of Chitosanase Produced by Bacillus circulans MH-K1." J.Gen.Appl.Microbiol.38. 135-144 (1992)

[文献書誌] Yoshida,N.: "Characterization of an Abonermal Firinogen Osaka V with the Replacement of γ-Arhinine 375 by Glycine.The Lack of High Affinity Calcium Binding to D-Domains and the Lack of Protective Effect of Calcium of Fibrinolysis." J.Biol.Chem.267. 2753-2759 (1992)

[文献書誌] 平田 肇: "日本生化学会編新生化学実験講座第6巻生体膜と膜輸送(上)第3章第5節平面膜へのFoF1-ATPaseの組込みと解析" 東京化学同人, 6 (1992)

1992 年度実績報告書

平田肇姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)

[文献書誌] 平田肇: "日本生化学会編新生化学実験講座第6巻生体膜と膜輸送(上)第3章第5節平面膜へのFoF1-ATPaseの組込みと解析" 東京化学同人, 6 (1992)