クリスタログラフィックワークベンチの構築とヒドロゲナーゼの構造解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04403026
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 安岡 則武 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40029054)
• 研究分担者: 岬 真太郎 姫路工業大学, 理学部, 助手 (30244685) ; 樋口 芳樹 姫路工業大学, 理学部, 助教授 (90183574)
• キーワード: クリスタログラフィックワークベンチ / ヒドロゲナーゼ / X線構造解析 / 異常散乱法 / 重原子同型置換法 / 電子密度分布 / 鉄イオンクラスター / ネットワーク

研究概要

クルスタログラフィックワークベンチ、すなわち実験室規模におけるタンパク質立体構造のX線回折法による一貫解析システムを構築するとともにこれを活用して硫酸還元菌のヒドロゲナーゼの構造解析を行った。グラフィックワークステーションによってX線回折装置を制御するとともに測定したピクセルデータから構造因子を算出するソフトウエアを新たに開発した。このシステムを活用してヒドロゲナーゼ結晶のX線回折を行った。同型置換法により6Å分解能の電子密度を得ることに成功し、さらにその位相情報と多波長異常分散法による回折データから鉄・イオウのクラスターとニッケル原子の位置を区別して同定することに、成功した。初期電気密度図は水銀、ウラン、白金など6種類の重原子誘導体を用いた多重同型置換法によりプログラムPROTEINを用い、ネイティブ構造因子の最良位相角とその重みを求めた。6Å分解能におけるこの重みの平均値は0.76であった。その後この6Å分解能の電子密度の溶媒領域を決定し、溶媒領域の平滑化による電子密度の改良を行った。その結果位相はさらに改良され、この位相と観測構造因子から計算した電子密度図に他と比べて明らかに大きく、孤立したピークを4つ見つけることができた。分解能はさらに4Åに拡張し、鉄原子の異常分散効果の大きな波長である1,74Å(Δf′=-6.1)と1.73Å(Δf′=-4.5、Δf″=3.9)、ニッケル原子の異常分散効果の大きな波長の1.49Å(Δf′=-0.9、Δf″=3.0)及びどちらの原子の異常分散効果も小さな1.04ÅのX線で測定した回折データの異なる波長間(F(1.04Å)-F(1.74Å),F(1.04Å)-F(1.48Å))やバイフット対間(F^+(1.73Å)-F^-(1.73Å))の構造因子の差と同型置換法による位相(バイフット対の場合α_<MIR>-π/2)を用いた差フーリエ図を計算したところ、先に述べた4つのピークをニッケル(1個)と鉄・イオウのクラスター(3個)と同定することができた。これらの各金属原子の位置を多波長異常分散効果を考慮した方法で精密化した結果、原子パラメータは占有率、座標、温度因子とも収束した。

研究成果

• [文献書誌] Y.Higuchi,H.Akutsu,and N.Yasuoka: "A detailed comparison of the refined structures of cytochrome c3 molecules from two strains in Desulfovibrio vulgaris:The relationship between the heme structures and redox properties" Biochimie. 76. 537-545 (1994)
• [文献書誌] Y.Higuchi,S.Misaki,Y.Morimoto and N.Yasuoka: "Location of Active Sites of NiFe Hydrogenase determined by the Combination of Multiple Isomorphous Replacement and Multiwavelength Anomalous Diffraction Methods" Acta Crystallographica. D50. 781-785 (1994)
• [文献書誌] I.Fujii,N.Hirayama,S.Misaki,Higuchi,and N.Yasuoka: "An Integrated X‐ray Measurement and Computation System in Protein Crystallography Y." Bioimages. 2. 143-148 (1994)
• [文献書誌] I.Fujii,N.Hirayama,Y.Higuchi,and N.Yasuoka: "XVIEWER‐An Interactive Image Processing Program for Diffraction Data from the Weissenberg Camera for Macromolecular Crystallography" Bioimages. 2. 47-52 (1994)
• [文献書誌] N.Yasuoka,S.Sugiyama,Y.Morimote,Y.Higuchi: "On the Active Sites of Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F" Jpn.J.Appl.Phys.32. 553-555 (1993)
• [文献書誌] A.Yoneda,T.Hakushi,Y.Morimoto and N.Yasuoka.: "Intramolecular Hydrogen Bonding within Cyclometalated Palladium(II) Complex Containing L(-)1-Phony lethy Iamine Ligand" Chemistry Letters. 175-176 (1994)