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1.c-Mycタンパク質生産系の確立
これまでの研究で我々は大腸菌を使ってc-Mycタンパク質のbHLH/LZ領域の生産を試みてきたが効率よく生産させることが出来なかった。今年度は、この原因が、この領域中にある2つの連続する大腸菌の希なコドン(ARG;AGG)に起因するのではないかと考え、ここを他のコドンに置換したc-Myc遺伝子からのタンパク質発現を試みた。PCR法でこの領域のコドンを置換後、発現ベクターpQEにクローン化し、大腸菌M15[pREP4]とSG13009[pREP4]株に形質転換し発現誘導したが、c-Mycタンパク質の発現はみられなかった。
2.Maxタンパク質生産系の確立とその構造学的特性の解析
今年度はc-Mycと二量化するパートナーで、似た構造をもつMaxタンパク質の大腸菌による生産系の確立も行った。ヒト胎児脳cDNAライブラリーよりPCR法で得たMax遺伝子を発現ベクターpQEにクローン化し大腸菌M15[pREP4]に形質転換し発現誘導したところ1リットル培地から約20mgの純粋なMaxタンパク質を得ることが出来た。これを再生した後、CD解析を行ったところ約50%のα-ヘリックス含量を示した。また、これに特異的結合配列を含むDNAオリゴマーを加えるとヘリックス含量が急激に増加することがわかった。さらに、このタンパク質のDNA結合能をゲルシフトアッセイで解析したところ高い結合能を示した。これらのことから、今回作成したMaxタンパク質は生物学的機能を有することがわかり今後NMR等で高次構造の解析を行うことにしている。
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