膜蛋白質を用いた高感度脂質二分子膜型センサーの構築

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04453156
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 小田嶋 和徳 北海道大学, 理学部, 助教授 (30152507)
• 研究分担者: 中山 仁 北海道大学, 薬学部, 助教授 (70088863) ; 梅澤 喜夫 東京大学, 理学部, 教授 (80011724)
• キーワード: バイオセンサー / イオンチャンネル蛋白質 / 平面脂質二分子膜 / グルタミン酸受容性イオンチャンネル / 電位作動性イオンチャンネル / チャンネル電流 / クーロメトリー / バリノマイシン

研究概要

生体膜中のイオンチャンネル蛋白質が持つ顕著なシグナル増幅能を、目的化学物質の高感度センシングの新しい原理として一般化することを目的として種々の基礎検討を行なった結果、以下のような知見を得た。
(1)ラット小脳シナプス膜よりグルタミン酸受容性イオンチャンネル蛋白質(GluR)を純度・収率良く単離精製するためには、特にグルタミン酸を吸着させたグラスファイバーによるアフィニティー濾過において、洗浄前処理が重要であることが見出された。
(2)単離精製されたGluRをリポリーム融合法または単分子膜貼り合わせ法により平面脂質二分子膜に埋め込み、右図のような実験系において、グルタミン酸の添加に伴うチャンネル電流の観測を試みた。その結果、チャンネル電流特有の矩形波が観測され、GluRの埋め込みが確認された。ただし現段階では再現性に問題があり、より確実な埋め込みのためには加える蛋白質の濃度と量、リポリームの融合のための溶液条件と放置時間を始めとする各種条件の検討が必要であることが明らかとなった。
(3)電気ウナギの発電器官より電位作動性イオンチャンネル蛋白質を単離精製するための基礎検討を行い、純度の高い目的蛋白質を得るためには、特異的抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製が有効であることが明らかとなった。
(4)上記蛋白質をK^+イオンレセプターであるバリノマイシンと共に平面脂質二分子膜に埋め込み、K^+イオンの添加に伴う膜電位変化により生起されるチャンネル電流の観測を試みたが、電位固定回路の中で膜電位変化が補償されてしまうことが問題点として明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] E.K.Michaelis: "Purification,Reconstitution,and Cloning of an NMDA Receptor-Ion Channel Complex from Rat Brain Synaptic Membranes:Implications for Neurobiological Changes in Alcoholism" The Annals of the New York Academy of Sciences. 654. 7-18 (1992)
• [文献書誌] K.Tohda: "Liquid Membrane Electrode for Guanosine Nucleotides Using a Cytosine-pendant Triamine Host as the Sensory Element" Analytical Chemistry. 64. 960-964 (1992)
• [文献書誌] K.Odashima: "Chemical Sensing Based on Membrane Potential Change Induced by Host-Guest Complexation at Membrane Surface" Supramolecular Chemistry. 2. (1993)
• [文献書誌] K.Odashima: "Voltammetric Study on a Condensed Monolayer of Long Alkyl Cyclodextrin Derivative as a Channel Mimetic Sensory Membrane" Analytical Chemistry. 65. (1993)
• [文献書誌] K.Odashima: "Potentiometric Discrimination of Organic Amines by a Liquid Membrane Electrode Based on a Lipophilic Hexaester of Calix[6]arene" Analytical Chemistry. 65. (1993)
• [文献書誌] K.Manabe: "Chromatographic Separation of Aromatic Guest Compounds by a Gel-immobilized Water-soluble Cyclophane" Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 40. 580-584 (1992)