植物の遺伝子発現機序を利用した培養細胞による物質生産系の構築

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04454037
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 新名 惇彦 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (30029235)
• 研究分担者: 関根 政実 大阪大学, 工学部, 助手 (70226653)
• キーワード: タバコ培養細胞 / β-グルクロニダーゼ / 物質生産 / プロモーター / シロイヌナズナ / 熱ショック遺伝子 / 傷害誘導 / 細胞周期 / サイクリン

研究概要

遺伝子組換え技術を用い植物細胞培養による物質生産を効率よく行わせる、新しい系の開発を目指し、本年度は宿主細胞として選んだタバコ培養細胞、Nicotiana tabacum BY2の増殖速度に関わる細胞周期制御遺伝子、サイクリンの解析と、外来遺伝子を高発現させるプロモーターおよび発現を誘導・制御できるシスエレメントの検索を行った。
1)培養温度による遺伝子発現のON-OFF制御が可能で、かつ高発現プロモーターの候補として、シロイヌナズナ、Arabidopsis thaliana、の熱ショックタンパク質遺伝子、HSP18.2の熱ショックプロモーターを選んだ。熱ショックエレメントを含む約700bp断片をβ-グルクロニダーゼ(GUS)構造遺伝子に連結し、タバコ培養細胞の染色体に組み込んだ。タバコ細胞の生育温度は25-28℃が最適であるが、GUS活性は極めて低く、期待どうり35-37℃で高い活性を示した。培養温度を25℃から37℃にシフトするとGUSのmRNAは15分後に検出され、2時間で最大値に達し、4時間後にはほぼ消失した。一方、酵素活性は4時間まで急速に上昇し、24時間までほぼ一定であった。37℃での酵素活性は25℃での値の約3000倍と極めて高い熱ショック誘導が転写レベルで起こることが確認された。
2)西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ遺伝子、prxC2、のプロモーターはタバコ細胞で高い転写活性を有すること、およびそのプロモーター上流、-289bpに傷害による発現誘導に関するCACGTGをコアとするシス配列の存在が明らかにした。このシス配列を破壊したプロモーターでは、タバコ細胞でのGUS活性が明らかに低下した。培養細胞での遺伝子の高発現にはこのシス配列が有効であると考えられる。
3)真核生物の細胞周期の進行を制御しているプロテインキナーゼの活性を調節するサイクリンのcDNAをタバコ茎頂から3種類単離した。タバコ細胞の同調培養において、各遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで解析した結果、いずれもG2からM期に発現するG2サイクリンであった。3種のサイクリン遺伝子のアンチセンスRNAをプローブにタバコ茎頂、根端部についてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、予想通り増殖が盛んな組織において転写物が検出された。

研究成果

• [文献書誌] Kawaoka,A.,T.Kawamoto,M.Sekine and A.Shinmyo: "Induction of horseradish peroxidase isozyme by wounding" Ann.New York Acad.Sci.721. 248-249 (1994)
• [文献書誌] Kawaoka,A.,T.Kawamoto,M.Sekine,K.Yoshida,M.Takano and A.Shinmyo: "A CIS-acting element and a trans-acting factor involved.in the wound-induced expression of a horseradish peroxidase gene" Plant j.6. 87-97 (1994)
• [文献書誌] 新名惇彦: "西洋ワサビのペルオキシダーゼ遺伝子の傷害による発現誘導" 日本農芸化学会誌. 68. 1686-1688 (1994)
• [文献書誌] Shinmyo,A.,A.Kawaoka and C.Intapruk: "Advances lin Plant Biotechnology" Elsevier, 373 (1994)
• [文献書誌] 新名惇彦: "食品機能の変換・高度化技術" フードデザイン技術研究組合, 283 (1994)
• [文献書誌] Fujiyama,K.,C.Intapruk and A.Shinmyo: "Peroxidases,Structure and Molecular Biology" London College Press(印刷中), (1995)