研究課題/領域番号 |
04454111
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研究機関 | 北海道大学 |
研究代表者 |
佐藤 文昭 北海道大学, 獣医学部, 教授 (10162471)
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研究分担者 |
遠藤 大二 北海道大学, 獣医学部, 助手 (40168828)
昆 泰寛 北海道大学, 獣医学部, 助手 (10178402)
林 正信 北海道大学, 獣医学部, 助教授 (10130337)
桑原 幹典 北海道大学, 獣医学部, 助教授 (10002081)
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キーワード | ハイブリッド組織化学 / インサイチュウハイブリダイゼーション / ジゴキシゲニン / 潜在感染 / マレック病ウイルス / 燐酸化蛋白質 / ICP4ホモローグ / テロメア |
研究概要 |
本研究の目的は、ハイブリッド組織化学を用いて潜伏感染が成立する際のウイルスゲノムの変化を解析することである。本年度は、ハイブリッド組織化学のための実験条件を整備した。潜伏感染ウイルスはコピー数が少なく、染色体への組み込みが行われた場合には一コピーのみの存在となることが予想される。この様なウイルスを解析するための方法としては、高感度および高信頼性のハイブリッド組織化学技術が必要とされる。また、ウイルスの核内での局在を解析するためには、電子顕微鏡を用いた観察も必要となる。一方、当該研究グループが利用するRI施設内には電子顕微鏡がないことから、非RI法によりプローブを標識する方法を選択した。非RI法のプローブは、一般に信頼性がRI法に比べ劣ると言われている。本研究では信頼性が高いジゴキシゲニン標識プローブを用いることとした。さらに、転写プローブを使用する事によりウイルス検出の特異性と感度を高くした。一方、転写プローブを用いる場合、プローブが断片化しやすいため、ハイブリダイゼーション溶液の組織および温度については十分な検討を加える必要がある。本年度はそのための条件設定を腎臓のレニン遺伝子を用いて行った。その結果、最適のハイブリダイゼーションの条件を設定すると共に、300-500塩基対のプローブが組織切片への浸透性と特異性に優れていることを見いだした。 上記の条件設定と並行して、ウイルスおよび染色体末端領域(テロメア)プローブを作出した。ウイルスとしては鶏のヘルペスウイルスであるマレック病ウイルスを用いた。まず、テロメアプローブを転写プローブ作出用のプラスミド(プルースクリプト)に300塩基対の長さにして挿入した。続けて、ウイルスの局在を示すための特異性プローブとして、燐酸化蛋白質(PP38)とICPホモローグ遺伝子から300-500塩基対の断片をブルースクリプトに挿入した。
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