| 研究概要 |
本研究は急速凍結フリーズ・レプリカ法により、Ca^<2+>-チャネルを形成する2種類の蛋白質、1,4,5-イノシトール3燐酸受容体(以下IP_3R)およびライアノジン受容体(以下RyaR)の構造を比較検討し、その機能に伴う分子構造変化を観察することを目標としている。初年度には骨格筋筋小胞体膜内に存在するRyaRの生理的な構造を捉えたので、今年度はその立体構造を定量的に検討する目的で、共同研究により数枚の傾斜電子顕微鏡像からコンピュータにより3次元像を再構築をするプログラムをほぼ完成し、予備的に数個の粒子に適用してみた。その結果4量体分子中央の切れ込みの周囲が最も高いなど、これまでに精製分子から得られている3次元構造とよく符合していた。今後、像の回転平均や多くの分子の像の平均化を行うことで更に高い分解能の情報が得られることが期待される。一方、IP_3Rは、小脳プルキンエ細胞内の滑面小胞体、なかでもstacked cistern(以下SC)と称される特異な層状構造の膜内に高密度に分布することが知られているが、その立体構造に関する情報は皆無であった。そこでその局在の特徴を利用して細胞内において分子を同定し、リガンド結合の際の構造変化を見いだすことを目標に研究を進めた。牛小脳スライスをナイロン・メッシュにかけて神経細胞を分散させ蔗糖密度勾配遠心法により分離したプルキンエ細胞は細胞体が非常に大きく、内部に豊富な層状小胞体構造を含むことが判明した。この方法によって調製した細胞の細胞膜には大きな穴があいており、内部の溶液組成を変えたり各種のプローブを導入することが容易で各種の応用が考えられる。このような試料のフリーズ・レプリカ像は多くのSCを含みその膜には約15nm周期の格子状に配列したひも状の分子群が観察されたが、超薄切片像との対応からこれがIP_3Rであろうと推定される。更に、機能に伴う構造変化、分子内ドメインとの対応などを検討している。
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