| 研究概要 |
1.レトロウイルスへの外来遺伝子の導入
(1)Moloney Murine Leukemia Virus(Mo-MuLV)を用いた。
(2)pZip Neo SV(X)1にChloramphenicol acetyl transferase (CAT) geneを挿入したpZip-CAT vectorを作製した。
(3)E.coliのβ-galactosidase(β-gal)をコードするlac Z geneを挿入したBAG virus vectorを作製した。
(4)Helper virusの助けを借りて、packaging signalを欠いたψマイナスであるψ-cell lineを作製した。
(5)ψ-cellにCa_3(PO_4)_2法を用いてCAT vector及びBAG vectorを組み入れた。
(6)Neo^Rを利用し、Neomycin培地にてvirus producing cell lineを選別し、prosducing cellを凍結保存した。
2.外来遺伝子組み換えウイルスの濃縮
(1)凍結保存されたvirus producing cellを100mm dishにまき、37℃で培養した。
(2)3-7日後、trypsin処理により回収後、100mm dishを10ケ位に増し、virus producing cellを増殖した。
(3)上澄みのみを集め遠心し、また上澄みのみを集め超高速遠心し、上澄みを除去後、除去された上澄みの約1%量のmediumを加えpipetingを行い、filterにて濾過し、凍結保存した。
3.ウイルス産生細胞の免疫組織学的検定
(1)virus producing cellをカバーガラス上にて培養した。
(2)カバーガラスを取り出し、PBSにて洗浄し、4%パラフォルムアルデヒドにて固定。再度PBSにて洗浄した。
(3)カバーガラスに一次抗体、二次抗体と順に滴下した。
(4)ABC(Vecterstain)液を滴下し、DAB,H_2O_2にて発色した。
(5)検鏡した結果、CAT陽性細胞を確認した。
4.ウイルス感染の免疫組織学的検定
(1)カバーガラスにNIH3T3細胞を培養した。
(2)濃縮したウイルスを加え、neomycinを追加し、さらに2日間培養した。
(3)3の(2)〜(4)と同様に免疫組織化学法を行い、検鏡した結果、CAT陽性細胞を確認した。
5.平成4年10月1日付にて、本学生理学第一講座への転任のため、当初の研究計画中、動物への接種が不可能となり、すべての実験をin vitroの系へと変更せざるをえなくなった。しかし、本学に赴任以前に、本年度研究経過にて記述した組換えvirusをラット20匹に接種実験を行った。接種後、経時的に動物を固定し、嗅粘膜を脱灰し、切片を作製した。抗CATを用いて免疫組織化学法にて検索したが、CAT陽性細胞は見られなかった。作製されたvirus producing cell lineのtiterが低いのか、virusのenv geneの感染力が低いのか、今後の問題である。env geneを変えるのは危険であるため、titerの高いvirus producing cell lineの作製が要求された。
6.最後に、転任に伴い、設備品の発注、納入が大幅に遅れ、研究は未だ再開できず、研究計画は遅延している。
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