| 研究課題/領域番号 |
04454147
|
|---|
| 研究機関 | 杏林大学 |
|---|
研究代表者 |
遠藤 仁 杏林大学, 医学部, 教授 (20101115)
|
|---|
| 研究分担者 |
関根 孝司 杏林大学, 医学部, 助手 (50255402)
水野 章子 杏林大学, 医学部, 助手 (60255403)
武田 理夫 杏林大学, 医学部, 助手 (40255401)
|
|---|
| キーワード | アルギニンバソプレシン / 単一ネフロン / 近位尿細管 / 細胞内遊離カルシウム / トランスジェニックマウス / V_2受容体 / SV40-T抗原 / 発現クローニング |
|---|
| 研究概要 |
初年度に明確にできたVp受容体の腎組織内局在の状況証拠をもとに更にその実態を追求するためにVp受容体のクローニングを以下の方法で試みた。
1、クローニングの材料の選択:我々はVp受容体のクローニングの材料として初年度に樹立したSV-40largeT抗原導入トランスジェニックマウスから微小単離法で採取した近位尿細管起始部(S1)由来の細胞が本目的に最適と考え同細胞のスクリーニングを試みた。すなわち非クローン細胞及び単個培養法で得られたクローン化細胞のAVP応答性を細胞内にFura-2をloadし細胞内カルシウム濃度(〔Ca^<2+>〕_i)を測定してVp受容体の発現の最も高い細胞の選択を試みた。その結果AVP反応性は非クローン細胞およびクローン化細胞22クローン中10クローンで認められた。この高いVp受容体発現が認められた細胞をクローニングの材料として用いることとした。
2、PCRクローニング:既に構造が決定されているV_1、V_2及びオキシトシン受容体は膜貫通部位においてアミノ酸配列が極めてよく保持されている。そこでVp受容体もこれらと類似性をもつと考え、そのアミノ酸配列を基にdegenerative primerを作製し、上記の細胞から抽出したRNAを鋳型として鋳型量、塩濃度、サイクルそして厳密性について数々の条件でRT-PC法を行なった。しかしながら本報告書作成の時点では予想される長さのDNA増幅は認められていない。
3、実験手法を変えて、アフリカツメガエルの卵細胞を用いた発現クローニング法でVp受容体cDNAのクローニングを目下企画中である。
|
