生理活性を有するプロテオグリカン糖鎖の再構築に関する糖鎖工学的研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04454153
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 遠藤 正彦 弘前大学, 医学部, 教授 (20004616)
• 研究分担者: 泉 淳 弘前大学, 医学部, 助手 (20241458) ; 高垣 啓一 弘前大学, 医学部, 助教授 (70163160)
• キーワード: プロテオグリカン / 糖鎖工学 / 糖鎖再構築 / グリコサミノグリカン / 生理活性ドメイン / 細胞外マトリックス / エンド型グリコシダーゼ

研究概要

目的:遺伝子工学的に産生されるリコンビナントのタンパク質は、糖鎖が不完全な場合があるので、これを補うため糖鎖も人為的にコントロールする必要がある。このため、細胞外マトリックスのプロテオグリカンをモデルに、その糖鎖・グリコサミノグリカンの生理活性ドメインを他の糖鎖から、酵素的に再構築する糖鎖工学の確立を目標としてきた。
実験と結果:遺伝子工学における制限酵素やリガーゼのようなグリコサミノグリカン糖鎖に作用する酵素は見い出されていない。そこで、グリコシダーゼが主反応としての加水分解反応の他に、その逆反応としての糖転移反応も行い得ることに着目した。そして、グリコサミノグリカンとしてのコンドロイチン硫酸とヒアルロン酸を対象に、これに働くエンド型グリコシダーゼであるヒアルロニダーゼの、加水分解反応より糖転移反応を優先させる条件を検討した。その結果、効率よく糖転移反応を行わせる条件を見い出した。
次に、糖残基供与体の条件を検討し、還元末端を2-アミノピリジンで蛍光標識した八糖以上のオリゴ糖が、一方、糖残基の受容体として、培養細胞の産生する4-メチルウンベリフェリル-β-キシロシドをプライマーとして伸長した六糖以上のオリゴ糖が、それぞれ優れていることを見い出した。
これらの糖残基供与体、及び、糖残基受容体を、ヒアルロニダーゼの糖転移反応の至適条件でインキュベートすると、最高二十二糖まで糖鎖を伸長させること、また、いままで天然には見い出されていない非天然型の糖鎖もデザイン通りに組み換えて再構築させることができた。
本研究でグリコサミノグリカンを任意にデザイン通りに組み換えることができたことは、この糖鎖工学が技術的完成度に一歩近づいたことを意味し、今後バイオテクノロジーの発展を側面から一層支援していけるものと思われる。

研究成果

• [文献書誌] Takagaki,K.: "Characterization of hydrolysis and transglycosylation by testicular hyaluronidase using ion-spray mass spectrometry." Biochemistry. 33. 6503-6507 (1994)
• [文献書誌] Takagaki,K.: "Analysis og glycosaminoglycans by high-performance liquid chromatography." J.Biochem.Biophys.Methods. 28. 313-320 (1994)
• [文献書誌] Tanaka,K.: "Hyaluronate depolymerization activity induced by progesterone in cultured fibrolasts derived from human uterine cervix." FEBS Lett.347. 95-98 (1994)
• [文献書誌] Izumi,J.: "A novel oligosaccharide,xylosl β1-4xylosy1β1-(4-methyl-umbelliferone),synthesized by cultured human skin fibroblasts." J.Biochem.116. 524-529 (1994)
• [文献書誌] Higuchi,T.: "A method for determination of galactosyltransferase I activity synthesizing the proteoglycan linkage region." J.Biochem.Biophys.Methods. 29. 135-142 (1994)
• [文献書誌] Nakamura,T.: "A novel oligosaccharide,GlcAβ1-4Xylβ1-(4-methylumbelliferone),synthesized by human cultured skin fibroblasts." Biochem.J.304. 731-736 (1994)
• [文献書誌] Saitoh,H.: "Enzymic reconstruction of glycosaminoglycan oligosaccharide chain using the transglycosylation reaction of bovine testicular hyaluronidase." J.Biol.Chem.,. (in press).
• [文献書誌] Shibata,S.: "HNK-1-reactive novel oligosaccharide,sulfate-0-3GalcAβ-1-4Xylβ1-(4-methylumbelliferone),synthesized by cultured human skin fibroblasts." J.Biol.Chem.,. (in press).