感染性cDNAを用いたパラミクソウイルスの複製機構と病原性発現機序の解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04454200
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 伊藤 康彦 三重大学, 医学部, 教授 (00022872)
• 研究分担者: 河野 光雄 三重大学, 医学部, 助手 (00234097) ; 松村 治雄 三重大学, 医学部, 助手 (10229536) ; 鶴留 雅人 三重大学, 医学部, 助教授 (50159042)
• キーワード: パラミクソウイルス / パラインフルエンザウイルス / 感染性cDNA / RNAレプリコン

研究概要

PIV-2のP遺伝子とムンプスウイルスNP遺伝子の一部を結合した人工遺伝子を作製し、そのRNA転写物をPIV-2感染細胞にトランスフェクトし、その蛋白の合成を確立し、この系を用いてRNA-editing機構の解析を行なった。HeLa細胞にPIV-2を約m.o.i.5で感染させ、そのPIV-2感染HeLa細胞をヘルパー細胞として用い、RNA転写物をトランスフェクトし、その産物を検出しようとした。このヘルパーウイルス系を用いる方法では、他の細胞系でも行なってみたがいずれの組み合わせでも発現効率は低く、蛍光抗体法で細胞約10000個に1個程度の細胞にしかその産物が検出できなかった。ワクチニアウイルスのDNAにT7ポリメラーゼ遺伝子の組み込まれたリコビナントワクチニヤウイルス(以下単にワクチニヤウイルスと記載する)とbluescript vector内にPIV-2の各ポリメラーゼユニット(NP,P,L)を組み込んだコンストラクトを用いて以下の様な発現系を確立した。HeLa細胞にワクチニアウイルスを約m.o.i.2で感染させ、1時間後に各ポリメラーゼユニット(NP,P,L)を組み込んだコンストラクトとPIV-2-P(MuV-NP)コンストラクトをリポフェクチン法を用いてトランスフェクトした。5-10時間後に10%FCSを含むDMEMを添加し、更に24時間培養後、cell-lysateを作製し、ウエスタンブロット法および蛍光抗体法により解析を行なった。このシステムを用いて初めて、再現性良く高効率でRNAレプリコン活性を発現できるようになった。今後この系と完全長クローンを用いて、cDNAから感染性ウイルスを作製する系を完成させる積もりである。

研究成果

• [文献書誌] S.Kusagawa et al.: "Antigenic and molecular properties of Murayama virus isolated from cynomolgus monkeys:The virus is closely related to avian paramyxovirus type 2." Virology. 194. 828-832 (1993)
• [文献書誌] M.Kawano et al.: "Sequence determination of the P gene of simian virus 41:Presence of irregular deletions near the RNA-editing sites of paramyxoviruses." J.Gen.Virology. 74. 911-916 (1993)
• [文献書誌] Y.Furuichi et al.: "Some characteristics of an alpha-amylase inhibitor from phaseolus vulgaris(Cultivar great Northern)seeds." Biosci.Biotech.Biochem.57. 147-148 (1993)
• [文献書誌] Y.Ito et al.: "HN proteins of human parainfluenza type 4A virus expressed in cell lines transfected with a cloned cDNA have an ability to induce interferon a/b in mouse spleen cells." J.Gen.Virology. (in press).
• [文献書誌] H.Tsumura et al.: "The character od endogenous retrovirus in pancreatic b-cells of NOD mice." Lab.Anim.Sci. (in press).
• [文献書誌] H.Ohta et al.: "Molecular and Biological Characterization of Fusion Regulation Proteins(FRPs):Anti-FRP MAbs Induced HIV-Mediated Cell Fusion via an Integrin System" EMBO J.(in press).