体液イオン環境調節とNの、K・ATPase遺伝子の発現

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04454271
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 長野 敬 自治医科大学, 医学部, 教授 (70048940)
• 研究分担者: 猪原 直弘 自治医科大学, 医学部・生化学, 助手 (60232576) ; 川上 潔 自治医科大学, 医学部・生物学, 助教授 (54191016)
• キーワード: Na,K-ATPase / 転写制御 / alphaサブユニット / betaサブユニット / 制御領域 / 制御因子 / Sp1 / E-box

研究概要

Na,K-ATPaseのalphaとbetaアイソフォーム遺伝子各3種類のうち全組織で発現するalpha1、筋組織で発現制御が注目されるalpha2、神経細胞接着分子AMOGと同一物beta2の各遺伝子の5'上流制御配列を変異の導入等により解析し、配列に結合する制御タンパク質同定とcDNAでトランスフェクトした細胞の解析を進めた。
【.encircled1.】alpha1:ARE[-102〜-61]結合タンパク質として、ゲルシフト法でC1〜C3複合体が観察された。C1,C2は全細胞株で認められ、C3はMDCKとHeLa細胞にはあり、B103細胞やNamalvaでは検出されない。ARE領域をプローブとしたサウスウェスタンクローニングから、別に2種類の結合タンパク質を得た。一つ(AREB6)は部分配列既報のNi1-2-a(williams et al.,1991)が延長されたもので、7個のZn-fingerと、Gluに富む領域をもち、そのmRNAは心組織や骨格筋に存在し、肝、膵、脾では検出されない。他方のタンパク質はHEB(Hu et al.,1992)であった。HEBやAREB6のcDNAを培養細胞にトランスフェクトした場合、alpha1遺伝子転写への効果は細胞株や発現量により正負両様である。ARE内にはATF-1結合領域もあり、ATFの結合を確認した。ARE領域に6種類以上の蛋白質が結合し複雑に相互作用する全体像が判明してきた。【.encircled2.】alpha2:Sp1結合配列と類似配列GGGAGGと2個のE-boxを含む領域(-175〜-108)は筋芽細胞L6において数倍の転写促進活性を示す。Sp1結合による転写促進はKinetic synergism(Herschlag and Johnson,1993)モデルに適合する。促進にE-box結合タンパク質も関与する。【.encircled3.】beta2:ラツト神経芽細胞腫由来のB103細胞で、特異的制御エレメントAMREをすでに同定していたが、新たに確立したラット脳アストロサイト初代培養細胞や他の培養細胞株でも転写制御エレメントとしてのAMREの活性が確認された。AMREに結合するタンパク質のうち一つは、Sp1結合コンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチドにより結合が競合阻害される。さらに抗Sp1抗体による結合阻害がみられた。

研究成果

• [文献書誌] Kawakami,K.,Yanagisawa,K.,Watanabe,Y.,Tominaga,S.,Nagano,K.: "Different factors bind to the regulatory region of Na+.K+-ATPase alpha1 subunit gene in cell cycle." FEBS Lett. 335. 251-254 (1993)
• [文献書誌] Ikeda,K.,Nagano,K.,Kawakami,K.: "Possible implications of Sp1-induced bending of DNA on synergistic activation of transcription." Gene. 136. 341-343 (1993)
• [文献書誌] Ikeda,K.,Nagano,K.,Kawakami,K.: "Anomalous interation of Sp1 and specific binding of and E-box binding protein with the regulatory elemants of the Na,K-ATPase alpha2 subunit gene promotor." Eur,J.Biochem.218. 195-204 (1993)
• [文献書誌] Watanabe,Y.,Kawakami,K.,Hirayama,T.,Nagano,K.: "Transcription factors positively and negatively regulating the Na,K--ATPase alpha1 subunit gene." J.Biochem.114. 849-855 (1993)
• [文献書誌] Kawakami,K.,Watanabe,Y.,Araki,M.Nagano,K.: "Sp1 binds to the Adhesion Molecule on Glia ragulatory element that functions as a positive transcription regulatory element in astrocytes." J.Neurosci,Res.35. 138-146 (1993)
• [文献書誌] Kawakami,K.Suzuki-Yagawa,Y.,Watanabe,Y.Nagano,K.: "Identification and characterization of the cis-elements regulating the rat AMOG(Adhesion Molecule on Glia)/Na,K-ATPase beta2 subunit gene." J.Biochem.111. 515-522 (1992)
• [文献書誌] Kawakami,K.,Suzuki-Yagawa,Y.,Watanabe,Y.,Ikeda,K.,Nagano,K.: "In;Proceedings of the 7th International Sodium Pump Meeting.(in press)" Transcription factors regulationg the Na+/K+-ATPase genes.(1994)