| 研究課題/領域番号 |
04454372
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
緒方 敏子 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (80014314)
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| 研究分担者 |
野田 政樹 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (50231725)
二藤 彰 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (00240747)
川口 奈奈子 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (10200700)
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| キーワード | オステオポンチン / 遺伝子 / プロモーター / クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ / DEAE-デキストラン / トランスフェクション |
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| 研究概要 |
マウスのオステオポンチン遺伝子の上流部分のPST1フラグメント約1000bpのフラグメントのクローニングを行い、さらに-777〜+79まで、また-543〜+79まで及び-253〜+79までの3つのDNA断片をそれぞれExo-3-mung beanヌクレアーゼ法にて作製し、これをchloramphenicol-acetyltrans-fearse(CAT)を持つPSTOV-CATベクターにクローニングし、これによる骨芽細胞様細胞MC3T3E1ならびにROS17/2.8に対するトランスフェクションを行った。トランスフェクション方式はDEAEデキストラン方式によって行った。一方、リン酸カルシウム法によるトランスフェクションも行ったがほぼ同様の結果が得られている。DEAE法式では約5μgのベクターDNAを24時間培養後のそれぞれの細胞に投与し3ないし4時間後に1分間のグリセロールショックによりこのベクターを導入した。導入後、時間経過を追って24、48、72時間後に細胞抽出液を調整し薄層クロマトグラフィーによるCATアッセイを行った。この結果それぞれの3つのフラグメントを持つプロモーターはプロモーターの長さに相応した活性を示し、この活性が時間依存性であることが明らかとなった。この活性を強力なプロモーターを持つPSV2CATと比較すると最も長い777〜+79までのフラグメントを持つCATベクターはPSV2に近く、また最も短い-253〜79までのフラグメントを持つCATベクターはPSV2CATの約1/10程度の活性を持っていた。
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