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歯髄細胞増殖因子および象牙質形成差導因子を分離精製すべく、ウシ脱灰象牙質基質からハイドロキシアパタイトアフィニティクロマトおよびヘパリンセファロースアフィニティクロマトによって部分精製された画分をさらに精製に用いた。すなわち、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトにより0.5MNaClで抽出させた画分を高速液体クロマトの逆相カラム、Octadecylー4PW(TOSOH)を用いて精製した。溶媒としては0.1%トリフルオロ酢酸および100%アセトニトリルを用い、アセトニトリル0%より濃度勾配を形成し抽出したところ、アセトニトリル20%ー70%の間で蛋白のピークがみられた。各フラクションを凍結乾燥し、50mM塩酸に再溶解し、ウシ歯髄培養細胞を用いて活性をアッセイした。DNA合成に関しては40-47%アセトニトリル抽出画分に強い促進活性のピークがみられた。アルカリフォスファターゼ活性に関しては20-27%付近の抽出画分に促進活性があり、40-60%付近に抑制活性がみられた。プロテオグリカン合成に関しては20-33%付近に促進活性がみられ、オステオカルシン合成に関しては27-33%付近に促進活性がみられた。継代細胞に各画分を投与して細胞形態観察を行ったところ、40-47%抽出画分では12時間以内にnoduleが形成され、その後細胞がplateからはがれる現象が生じた。4日以内に多くの画分でそれに類似した現象が生じたが、27-33%付近で抽出される画分では象牙芽細胞様の細胞が細長く一定方向に並び所々で峰を形成していた。今回の結果から歯髄細胞増殖因子は40-47%アセトニトリル抽出画分に存在し、象牙質形成誘導因子は27-33%抽出画分に存在する可能性があることが示唆された。したがって、さらにその蛋白を大量に精製し、invivoにおける象牙質誘導能を調べるとともに、アミノ酸一次構造を決定する予定である。
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