| 研究概要 |
歯髄細胞増殖因子および象牙質形成誘導因子を分離精製すべく、ウシ脱灰象牙質基質からハイドロキシアパタイトアフィニティクロマトおよびヘパリンセファロースアフィニティクロマトによって部分精製された画分をさらに精製に用いた。すなわち、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトにより0.5MNaClで抽出された画分を高速液体クロマトの逆相カラム、Octadecyl-4PW(TOSOH)を用いて精製した。溶媒としては0.1%トリフルオロ酢酸および100%アセトニトリルを用い、アセトニトリル20%より濃度勾配を形成し抽出したところ、アセトニトリル20%-70%の間で蛋白のピークがみられた。各フラクションを凍結乾燥し、25mM塩酸に再溶解し、ウシ歯髄培養細胞を用いて活性をアッセイした。アルカリフォスファターゼ活性に関してフラクション13,14および15(アセトニトリル48〜69%)に活性がみられた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、切り出したバンドからエレクトロエリューターにて蛋白質を抽出したところ、フラクション13では31kDaにアルカリフォスファターゼ活性抑制作用がみられ、フラクション14では25kDaにDNA合成促進作用がみられた。25kDa蛋白質では還元条件下で12.5kDaに分割されたが、31kDa蛋白質では変化がみられなかった。この25kDaおよび31kDa蛋白質を大量に集め、現在部分アミノ酸一次構造を解析中である。
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