| 研究概要 |
インスリンは膵島β細胞で前駆体B鎖-Arg-Arg-Cペプチド-Lys-Arg-A鎖として産生され,転換酵素PC1,PC2によって塩基性アミノ酸対部分が限定切断をうけ,新たに露出したカルボキシル端塩基性アミノ酸がカルボキシペプチダーゼH(CPH)によって除去されて,A鎖とB鎖から成る生理活性型インスリンになる。我々はどの細胞にも存在する限定切断酵素Furinの切断をうけるようにcDNAをB鎖-Arg-Arg-Lys-Arg-Cペプチド-Arg-Arg-Lys-Arg-A鎖に変異させ,非内分泌細胞で生理活性型インスリンへの転換を試みた。モンキー腎上皮由来COS,ハムスター子宮由来CHO,マウス胎児由来NIH3T3,ヒト肝癌由来HepG2の各細胞から培養液中に放出されたインスリン免疫活性はセファデックスG-50によるゲル濾過でインスリン分画にCHO 50%,COS 60%,HepG2 70%,NIH3T3 80%溶出された。又各細胞のFurinはインスリンへの転換率が高い細胞程,発現していることが分かった。Furinで切断されたインスリンのB鎖カルボキシル端の塩基性アミノ酸が正しく除去されていることを調べるため,インスリン分画をイオン変換クロマトグラムとHPLCで分析した。各細胞におけるCPHの発現をノザンブロットで解析すると,NIH3T3は多量の,HepG2は中等量のCPHを含んでいたが,COSとCHOではCPHは発現していなかった。しかし各細胞からのインスリンはCPH発現の有無にかかわらずイオン交換クロマトグラムでもHPLCでも標準インスリンと同じ位置に流出し,余剰の塩基性アミノ酸が除去されていることを示した。このことは非内分泌細胞でもFurinと更にある種のカルボキシペプチダーゼによって変異プロインスリンを生理活性型インスリンに転換できることを示した。今後インスリン発現をグルコース等で調節することによって糖尿病遺伝子治療への基礎を作る予定である。
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