活性毒素フラグメント〔A〕を用いた破傷風毒素の神経伝達阻害作用の分子機構の解明

1993 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 04454915
• 研究種目: 一般研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 松田 守弘 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20029771)
• 研究分担者: 堀口 安彦 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (00183939) ; 岡部 登志男 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (80204014) ; 杉本 央 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (20142317)
• 研究期間 (年度): 1992 – 1993
• キーワード: 破傷風毒素 / 毒素フラグメント / 細胞内局在 / 開口分泌 / クロマフィン細胞 / プロティンキナーゼC / カルモデュリン / テタノリジン

研究概要

ジギトニンで透過性にしたウシ副腎クロマフィン細胞ノルエピネフリン(NE)開口分泌系で破傷風毒素、毒素フラグメント[A](L鎖)が内在性NE放出をも殆ど完全に阻害することを示し、中毒細胞の細胞情報伝達過程の変化を毒素の標的物質と見なされている細胞内情報物質や開口分泌に関与が推定されているCa^<2+>結合蛋白質との関連において調べ、cGMP,cGMP特異的ホスホジエステラーゼ、ANF依存性グアニレートシクラーゼ、C-キナーゼと毒作用との関係をはっきりと否定した。またcAMP,A-キナーゼやカルモデュリンと本毒素の作用点とは直接関係がないことを示した。その際、開口分泌にカルモデュリンが関与していることを直接示すことができ、ミオシン軽鎖を介する経路の関与を示し、C-キナーゼがmodulatorとして働いていることを明らかにした。中毒細胞の蛋白質リン酸化を本毒素が変化させないことを示した。中毒細胞における毒素結合物質の局在やその細胞骨格との関係を電顕的および抗L鎖抗体を用いて免疫組織化学的に調べ、透過性細胞は形質膜に損傷がみられるがCa^<2+>依存性NE放出機構はよく保たれ、毒素による阻害で開口分泌像がみられなくなり、開口分泌に伴うアクチンの細胞辺縁での断裂凝集化もなくなる結果を得た。二重蛍光染色の結果、毒素は分泌顆粒にほぼ一致して局在し、F-アクチンやカルパクチンIとは異なる分布をしていた。L鎖のin vitroでのZn依存性蛋白質分解活性がシナプス小胞膜随伴シナプトブレビン2を特異的基質とすることを確かめた。静注によるin vivo毒性はZnを除去した標品でも差がなかった。L鎖はin vitroでのカルパクチンI依存性分泌顆粒凝集系やCa^<2+>ホスホリパーゼA_2依存性膜融合系に影響を及ぼさなかった。従って破傷風毒素の作用点は、これらの物質の作用点と直接関係しない。テタノリジンを高度に精製して、その大きな孔形成特性を明らかにし、新しい高分子物質透過性開口分泌系を開発した。

研究成果

• [文献書誌] T.Okabe,N.Sugimoto and M.Matsuda: "Calmodulin is involved in catecholamine secretion from digitonin-permeabilized bovine adrenal medullary chromaffin cells." Biochem.Biophys.Res.Commun.186(2). 1006-1011 (1992)
• [文献書誌] 松田守弘 岡部登志男 杉本央: "ジギトニンで透過性にした副腎クロマフィン細胞からの開口分泌におけるカルモデュリン関与" 神経化学. 32. 194-195 (1993)
• [文献書誌] M.Matsuda,T.Okabe,N.Sugimoto,T.Senda and H.Fujita: "Tetanus toxin and Clostridium perfringens enterotoxin as tools for the study of exocytosis." Ann.N.Y.Acad.Sci.710. 94-106 (1994)
• [文献書誌] M.Matsuda,T.Okabe and N.Sugimoto: "Involvement of calmodulin in exocytotic secretion from digitonin-permeabilized bovine adrenal medullary chromaffin cells." Neurochem.Res.19(in press). (1994)
• [文献書誌] T.Senda,T.Okabe,M.Matsuda and H.Fujita: "Quick-freeze,deep-etch visualization of exocytosis in anterior pituitary secretory cells:localization and possible roles of actin and annexin II." Cell Tissue Res.275(in press). (1994)
• [文献書誌] M.Matsuda,T.Okabe,N.Sugimoto: "Tetanus neurotoxin:(1)Immunological roles of fragments of the toxin in protection,and(2)attempts to identify target site(s)of its toxin action." Plenum Publishing Corp,New York.(ed.B.R.DasGupta), 273-286 (1993)
• [文献書誌] M.Matsuda,M.Kamei,N.Sugimoto and S.Hashizume: "Application of anti-tetanus human monoclonal antibodies." Kluwer Academic Publishers.(eds.S.Kaminogawa et al.), 617-623 (1993)