1994 年度実績報告書

単一細胞由来遺伝子解析システム

研究課題

研究課題/領域番号	04557021
研究機関	千葉大学
研究代表者	谷口克千葉大学, 医学部, 教授 (80110310)
研究分担者	菅野雅元千葉大学, 医学部, 助教授 (40161393)
キーワード	単一細胞 / サブトラクション / アンカーPCR / cDNAライブラリー
研究概要	昨年までに我々は1ng以下の全RNAからcDNAライブラリー全体を増幅させることを可能にしたが、今年度は細胞からRNA抽出という過程を経ずに直接PCR増幅を行う方法の開発を行った。In-Cell PCRの方法を応用し、RNAの抽出というステップを経ずにcDNA合成-PCRを行う条件を様々な可溶化剤を用いて試みた。一般的に用いられるNP-40で可能なことが判明し、以後NP-40のみを用いている。当初の目的である「いかにして単一細胞由来のRNAを効率よく回収するのか?」という点に関しては、細胞からのRNA抽出を経ずに直接cDNA合成が可能となり、問題が解決した。現在までに1個の細胞からの全RNAの増幅に成功している。TCRハイブリドーマや培養細胞株などからβ-actionやT細胞抗原リセプターcDNAの増幅・検出が可能になった。次にサブトラクション法を応用し、細胞特異的なcDNAの濃縮を試みた結果、約10倍程度の濃縮は可能になった。今後の問題点は、(1)ビオチンを用いたサブトラクション法では現在までは約10倍以上の濃縮が困難であり改良の必要がある。両端に同じアダプターブライコ-が存在することが原因ではないかと考えられる。(2)ハイブリドーマなどの細胞を用いた場合は、1個の細胞からのcDNA全体の増幅が可能であった。しかし正常リンパ球を用いた場合には、コピー数が多いものが増殖されず、我々が本当に知りたい転写因子や膜表面抗原に関しては困難であり、約50個の細胞数を必要とした。この点も今後の課題である。

研究成果
(8件)

すべてその他

すべて文献書誌 (8件)

[文献書誌] Sumida.T.: "Prevention of insulitia and diabetes in β2-microgiobulin in-deficient non-obese diabtic mice." Int.Immunol.6. 1445-1449 (1994)
[文献書誌] Makino.Y.: "Extrathymic differentiation of a T cell bearing invariant VαI4Jα281 TCR." Intern.Immunol.11. 31-46 (1994)
[文献書誌] Sydora.B.C.: "Intestinal intraepitheliai Iymphocytes preferentially repopulate the intestinal epithelium." Int.Immunol.5. 743-751 (1993)
[文献書誌] Makino.Y.: "Extrathymic development of Vα14 positive T cells." J.Exp.Med.177. 1339-1408 (1993)
[文献書誌] Kimoto.H.: "The fetal thymus stores immature hemoppietic cells constituting the thymus stromal element." Int.Immunol.5. 1535-1540 (1993)
[文献書誌] Shirasava.T.: "Heavy chain variable (V_H)region diversity generated by V_H gene replacement in the progeny of a signal precursor cell transformed with a temperature-sensitive mutant of abelson nurine lekenia virus." J.Exp.Med.176. 1209-1214 (1992)
[文献書誌] Inaba.T.: "Doble-step and inverse polymerase chain reaction for sensitive detection and colning of T cell receptor variable region sequences." Int.Immunl.3. 1053-1057 (1991)
[文献書誌] Sumida,T.: "Molecular Approaches to the Study and Treatment of Human Diseases." Yoshida.T.O.and Wilson.J.M., (1992)

1994 年度 実績報告書

単一細胞由来遺伝子解析システム

研究代表者

谷口 克 千葉大学, 医学部, 教授 (80110310)

研究成果

[文献書誌] Sumida.T.: "Prevention of insulitia and diabetes in β2-microgiobulin in-deficient non-obese diabtic mice." Int.Immunol.6. 1445-1449 (1994)

[文献書誌] Makino.Y.: "Extrathymic differentiation of a T cell bearing invariant VαI4Jα281 TCR." Intern.Immunol.11. 31-46 (1994)

[文献書誌] Sydora.B.C.: "Intestinal intraepitheliai Iymphocytes preferentially repopulate the intestinal epithelium." Int.Immunol.5. 743-751 (1993)

[文献書誌] Makino.Y.: "Extrathymic development of Vα14 positive T cells." J.Exp.Med.177. 1339-1408 (1993)

[文献書誌] Kimoto.H.: "The fetal thymus stores immature hemoppietic cells constituting the thymus stromal element." Int.Immunol.5. 1535-1540 (1993)

[文献書誌] Shirasava.T.: "Heavy chain variable (V_H)region diversity generated by V_H gene replacement in the progeny of a signal precursor cell transformed with a temperature-sensitive mutant of abelson nurine lekenia virus." J.Exp.Med.176. 1209-1214 (1992)

[文献書誌] Inaba.T.: "Doble-step and inverse polymerase chain reaction for sensitive detection and colning of T cell receptor variable region sequences." Int.Immunl.3. 1053-1057 (1991)

[文献書誌] Sumida,T.: "Molecular Approaches to the Study and Treatment of Human Diseases." Yoshida.T.O.and Wilson.J.M., (1992)

1994 年度実績報告書

谷口克千葉大学, 医学部, 教授 (80110310)