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昨年までに我々は1ng以下の全RNAからcDNAライブラリー全体を増幅させることを可能にしたが、今年度は細胞からRNA抽出という過程を経ずに直接PCR増幅を行う方法の開発を行った。In-CellPCRの方法を応用し、RNAの抽出というステップを経ずにcDNA合成-PCRを行う条件を様々な可溶化剤を用いて試みた。一般的に用いられるNP-40で可能なことが判明し、以後NP-40のみを用いている。当初の目的である「いかにして単一細胞由来のRNAを効率よく回収するのか?」という点に関しては、細胞からのRNA抽出を経ずに直接cDNA合成が可能となり、問題が解決した。現在までに1個の細胞からの全RNAの増幅に成功している。TCRハイブリドーマや培養細胞株などからβ-actionやT細胞抗原リセプターcDNAの増幅・検出が可能になった。
次にサブトラクション法を応用し、細胞特異的なcDNAの濃縮を試みた結果、約10倍程度の濃縮は可能になった。
今後の問題点は、(1)ビオチンを用いたサブトラクション法では現在までは約10倍以上の濃縮が困難であり改良の必要がある。両端に同じアダプターブライコ-が存在することが原因ではないかと考えられる。(2)ハイブリドーマなどの細胞を用いた場合は、1個の細胞からのcDNA全体の増幅が可能であった。しかし正常リンパ球を用いた場合には、コピー数が多いものが増殖されず、我々が本当に知りたい転写因子や膜表面抗原に関しては困難であり、約50個の細胞数を必要とした。この点も今後の課題である。
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