部分肝移植後の穿刺吸引微量肝細胞による移植肝再生能評価法の開発

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04557057
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 田中 紘一 京都大学, 医学部, 助教授 (20115877)
• 研究分担者: 石崎 寛治 放射線生物研究センター, 助教授 (70111987) ; 本田 和男 京都大学, 医学部, 助手 (00209321)
• キーワード: 部分肝移植 / 移植肝機能評価 / 穿刺吸引細胞診 / PT-PCR

研究概要

生体部分肝移植術後のルチーン検査として実施することを目的とした、経皮穿刺吸引細胞診の手法で採取される少数の肝細胞内mRNA定量法の開発のため、ラット肝におけるアルブミンmRNAの発現量を、その遺伝子のexon4からexon5に相当する部分(siteA)とexon11からexon12に相当する部分(siteB)に対するcompetitiveRT-PCR法を用いた定量法により計測する方法を確立した。
competitor(internal control)としては、PCRの増幅効率の相異による測定誤差を最小限に抑さえるため、siteA・siteB各々にたいして末端から約20bpの部分にpoint mutationを導入した変異プライマーを作成して、cDNAをtemplateとしたPCRによって得られた産物を用いた。この際導入された変異によりrestriction siteが新たに生じるか、或いは消滅するように設計し、competitor由来のPCR productを当該のrestriction enzymeで消化したのち電気泳動を行うことによって、mRNA由来のPCR productから識別することができるようにした。
ところでnorthern blotting法によるmRNA定量ではtotal RNA量をそろえることによって細胞数を一定にするが、穿刺吸引細胞診の手法によって得られるごく微量の検体からは、そのような細胞数カウントの系を独立させることは物理的に困難である。そこで検体からIsoQuick^<TM>を用いて核酸全体を抽出し、SuperScriptPreamplificationKit^<TM>でmRNAより変換されたcDNAを、genomicDNAと分けることなく一緒に既知濃度のcompetitorと共に増幅して3者の量比をデンシトメトリーにて求めることによって、mRNA定量が可能であるだけでなく異なる微量検体間での比較ができるようなシステムが確立された。

研究成果

• [文献書誌] K.Tanaka: "Complication management in living related liver transplantation." American J.Surg. (in press).
• [文献書誌] K.Tanaka: "Postoperative management based on the Redox theory in living related liver transplantation in children" J.Japanese Society of Pediatr.Surg. 29. 256-263 (1993)
• [文献書誌] S.Fujita: "Living related liver transplantation for biliary atresia" Clinical Transplantation. (in press).
• [文献書誌] S.Uemoto: "Experience with FK506 in living-related liver transplantation" Transplantation. 55. 288-292 (1993)
• [文献書誌] K.Tanaka: "Liver transplantation in children from living-related donors" Transplant.Proc.25. 1084-1086 (1993)
• [文献書誌] K.Tanaka: "Living related liver transplantation" Transplant.Proc.24. 2252-2253 (1992)
• [文献書誌] K.Ozawa: "Living related donor liver transplantation" KARGER, 250 (1994)