| 研究課題/領域番号 |
04557057
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
消化器外科学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
田中 紘一 京都大学, 医学部, 助教授 (20115877)
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| 研究分担者 |
石崎 寛治 京都大学, 放射線生物研究センター, 助教授 (70111987)
本田 和男 京都大学, 医学部, 助手 (00209321)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| キーワード | 部分肝移植 / 移植肝機能評価 / 穿刺吸引細胞診 / RT-PCR |
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| 研究概要 |
生体部分肝移植術後のルケーン検査として実施することを目的とした経皮穿刺吸引細胞診の手法で採取される少数の肝細胞内mRNA定量法の開発のため、ラット肝におけるアルブミンmRNAの発現量を、その遺伝子のexon4からexon5に相当する部分(siteA)とexon11からexon12に相当する部分(siteB)に対するcompetitive RT-PCR法を用いた定量法により計測する方法を確立した。competitor(internal control)としては、PCRの増幅効率の相異による測定誤差を最小限に抑えるため、siteA・siteB各々にたいして末端から約20bpの部分にpoint mutationを導入した変異プライマーを作成してcDNAをtemplateとしたPCRによって得られた産物を用いた。この際導入された変異により、restriction siteが新たに生じるか、或いは消滅するように設計し、competitor由来のPCR productを当該のrestriction enzymeで消化したのち電気泳動を行うことによってmRNA由来のPCR productから識別することができるようにした。
ところで、northern blotting法によるmRNA定量ではtotal RNA量をそろえることによって細胞数を一定にするが、穿刺吸引細胞診の手法によって得られるごく微量の検体からは、そのような細胞数カウントの系を独立させることは物理的に困難である。そこで検体からIso Quick^<TM>を用いて核酸全体を抽出し、Super Script PreamplificationKit^<TM>でmRNAより変換されたcDNAを、genomic DNAと分けることなく一緒に既知濃度のcompetitorと共に増幅して3者の量比をデンシトメトリーにて求めることによって、mRNA定量が可能であるだけでなく異なる微量検体間での比較ができるようなシステムが確立された。
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