| 研究概要 |
培養細胞を汚染しているmycoplasmaを検出する方法の確立
1.培養
Difco PPLO broth(70ml)、horse serum(Gibco;20ml)、25%yeast extract(Flow;10ml)、0.05%thallium acetate、penicillin G(1,000U/ml)、0.002%phenol red(2ml)、そして1%arginineあるいはglucoseから成り、phを7.0(arginineを添加した場合)あるいは8.0(glucoseを添加した場合)に調整した培地を用いて、汚染mycoplasmaの検出法を確立した。
2.DNA染色
細胞をcover glassに付着させ、固定し、bisbenzamide fluorochrome(HoechstNo.33258)をDNAを染色して、蛍光顕微鏡で観察する。
3.PCR
Primer F1(5'-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3')、Primer R1(5'-CTTCA(or T)TCGACTTT(or C)CAGACCCAAGGCAT-3'4種のmixed primer)、Primer F2(5'-GTTCTTGAAAACTGAAT-3')、PrimerR2(GCATCCACCAA(or T)AA(or T)ACTCT-3'4種のmixed primer)を調製し、2-step PCRでmycoplasmaを検出する。
汚染mycoplasmaの除去方法を確立するための基礎実験
汚染培養細胞から高率に検出されるMycoplasma oraleあるいはMycoplasma fermentansを接種し、人為的に汚染したHeLa細胞を熱処理(50^0C、1分)あるいは0.5% Triton X-100添加Hanks液での処理の有効性を示唆する成績を得ている。
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