C型肝炎ウイルス遺伝子非構造領域NS3の発現産物を用いたプロテアーゼ阻害剤の開発

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04557125
• 研究機関: 国立予防衛生研究所
• 研究代表者: 宮村 達男 国立予防衛生研究所, ウイルスII部, 部長 (90100099)
• 研究分担者: 渡辺 勇四郎 聖マリアンナ医科大学, 第2内科, 講師 (00081688) ; 片山 透 国立東京病院, 院長 ; 鈴木 哲朗 国立予防衛生研究所, ウイルスII部, 研究員 (00250184)
• キーワード: 分子生物学 / C型肝炎ウイルス / プロテアーゼ

研究概要

C型肝炎ウイルス(HCV)のプロテアーゼ領域と推定される非構造蛋白質NS3及びその基質領域のcDNA(すでにクローン化済)の発現を試み以下のような成果を得た。
1)大腸菌での発現:tacプロモーターの支配下にマルトース結合蛋白質との融合蛋白質として発現させるpMALベクターにプロテアーゼ領域と推定されるHCVcDNAを挿入した。IPTG添加により発現を誘導した後、菌体抽出物をアミロース樹脂によるアフィニテイークロマトグラフに供した。マルトースで溶出後、濃縮、透析し融合蛋白質の精製を行った。一方、精製蛋白質のプロテアーゼ活性を検出するため、基質とする10アミノ酸残基からなるペプチドを合成した。このペプチドはHCVプロテアーゼによって認識、切断されると思われる部位の配列である。精製融合蛋白質とこの合成ペプチドを中性緩衝液中で37℃、1-12時間反応させ、加熱処理後、高速液体クロマトグラフに供した。その結果、12時間の反応で90%以上のペプチドの分解を認めた。更に、ペプチドシークエンサーにより分解物のアミノ酸配列を決め切断部位を同定した。
2)昆虫細胞での発現:HCV非構造蛋白質領域NS2/NS3のcDNAをトランスファーベクターpAcYM1に組み込み、昆虫細胞にトランスフェクション後、プラックアッセイにより組み換えバキュロウイルスを選択した。純化した組み換えバキュロウイルスを細胞に感染させ発現するHCV-NS2/NS3蛋白質をウエスタンブロット法及び免疫沈降法により検出した。更に、NS2/NS3蛋白質のプロセッシングを確認した。

研究成果

• [文献書誌] Matsuura,Y.,Miyamura,T.,et al.: "Expression of processed envelope protein of hepatitis C virus in mammalian and insecy cells." J.Virol.66. 1425-1431 (1992)
• [文献書誌] Katayama,T.,Miyamura,T.,et al.: "Improved serodiagnosis of non-A,non-B hepatitis by an assay detecting antibody to hepatitis C virus core antigen.Evidence for immune selection of HCV putative envelope" Hepatology. 15. 391-394 (1992)
• [文献書誌] Weiner,A.J.,Miyamura,T.,et al.: "glycoprotein varriants:potential role in chronic hepatitis C virus infections" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89. 3468-3472 (1992)
• [文献書誌] Inoue,Y.,Miyamura,T.,et al.: "Expression of the amino-terminal half of the NS1 region of the hepatitis C virus genome and detection of antibody to the expressed protein in patients with liver disease." J.gen.Virol.73. 2151-2154 (1992)
• [文献書誌] Inoue,Y.,Miyamura,T.,et al.: "Silent mother-to-child transmission of hepatitis C virus through two generations determined by comparative nucleotide sequence analysis of the viral cDNA." J.Inf.Dis.166. 1425-1428 (1992)
• [文献書誌] Kohara,M.,Miyamura,T.,et al.: "Expression and characterization of glycoprotein gp35 of hepatitis C virus using recombinant vaccinia virus." J.gen.Virol.73. 2313-2318 (1992)