胚・血液幹細胞の高効率発現ベクターの開発とGM-CSF/IL-3受容体マウスの作製

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04559003
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 新井 賢一 東京大学, 医科学研究所, 教授 (00012782)
• 研究分担者: 井上 達 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (50100110) ; 豊田 裕 東京大学, 医科学研究所, 教授 (90050418) ; 正井 久雄 東京大学, 医科学研究所, 助手 (40229349) ; 中山 直樹 東京大学, 医科学研究所, 助手 (80227967) ; 横田 崇 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (50134622)
• キーワード: エピゾーム / ポリオーマ / BPV / EBV / 複製 / E1 / E2 / EBNA

研究概要

本研究では胚幹細胞や血球幹細胞におけるエピソームベクターをポリオーマ、BPVあるいはEBVゲノムを用いて開発し、次いでこれらを用いてIL-3やGM-CSFとそのレセプター遺伝子を幹細胞や血液幹細胞に導入し、定常状態における造血や発生過程に於けるリンホカインの役割をマウス及び細胞レベル検討することを目的とする。
BPVはヒト及びマウスの細胞内で、一方EBVはヒト細胞内で複製し、エピゾーム状態で安定に存在することが知られている。またポリオーマウイルスはマウス細胞で複製する。これらのウイルスゲノムには細胞の増殖を促進したりトランスフォームしたりする遺伝子群が存在する。本年度はマウス細胞内でエピソームとして存在し、しかも細胞をトランスフォームしないベクターを確立するため、BPVを用いて複製起点及びBPVの複製タンパク質E1及びE2のみをウイルスゲノムより切り出し、同一のプラスミドに組み込んだ(EV5,EV6,EV51,EV61)。E1及びE2については発現レベルを安定化するために種々のプロモーターに接続した(EV5/EV6-PGK promoter for E1,EV51/EV61-PGK promoter for E1,CMV promoter for E2)。マウス繊維芽細胞C127を用いて一過性複製及び長期間にわたる安定的複製を検討したところ、E1及びE2の発現レベルが高く保持されることが必要であることが示唆された。現在複製効率を更に上昇させるためE1にもCMVプロモーターを接続することを検討中である。これによりマウス細胞用のエピゾームベクターが得られるものと考えている。EBVベクターについては既に複製起点(orip)と複製タンパク質EBNAのみからなるプラスミドを用いてマウス細胞に於ける一過性複製能を検討したが、現在のところマウス細胞での複製は検出されていない。またポリオーマ複製起点を含むプラスミドはT抗原をトランスに供給することでマウス白血病細胞内で効率良い一過性複製を確認している。

研究成果

• [文献書誌] Miyajima,A.et al: "Cytokine receptors and signal transduction" Ann.Rev.Immunol. 10. 295-331 (1992)
• [文献書誌] Abe,E.et al: "Eleven-base pair DNA sequence motif unique to human IL-4 gene confers responsiveness to T cell activation signals" Proc.Natl.Acad.Sci,USA. 89. 2864-2868 (1992)
• [文献書誌] Wang,H.M.et al: "Structure of mouse IL-3 binding protein(AIC2A):Amino acid residues critical for IL-3 binding" J.Biol.Chem.267. 979-983 (1992)
• [文献書誌] Koyano-Nakagawa,N.et al: "Reconstitution of the functional GM-CSF promoter:Evidence for distinct activation mechanisms that mediate the response to phorbol ester/calcium and HTLV-I Tax signals" Int.Immunol.5. (1992)
• [文献書誌] Muramatsu,M.et al: "Protein kinase C mutants in the auto-inhibitory region exhibit two distinct properties." FEBS Lett.311. 75-79 (1992)
• [文献書誌] Nakayama,N.et al: "Use of mamamlian cell expression clonings sytems to identify genes for cytokines,receptors,and regulatory proteins" Current Opin.Biotechnology. 3. 497-505 (1992)
• [文献書誌] Ozu,M.et al: "Regulation of the IL-3 gene and structure and function of the IL-3 receptor" Advance in Neuroimmunology. 2. 35-52 (1992)
• [文献書誌] Arai,N.et al: "Activation of lymphokine genes in T cells:Role of cis-acting DNA elements that respond to T cell activation signals (1992)" Pharmacology and Therapeutics. 55. 303-318 (1992)
• [文献書誌] Watanabe,S.et al: "Molecular biology of T cell derived cytokines and cytokine receptor network" Progress in Allergy and Clinical Immunology. 213-218 (1992)
• [文献書誌] Watanabe,S.et al: "Reconstituted human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) receptor transduces growth promoting signals in mouse NIH3T3 cells:Comparison with signalling in BA/F3 proB cells" Mol.Cell.Biol.(1993)