| 研究概要 |
アカパンカビの相同的組み換え,非相同的組み換え頻度を定量的に測定するためプラスミドpMTRを構築した。このプラスミドはメチルトリプトファン耐性遺伝子(mtr)の構造遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子(hyg^r)で分割した構造になっている。実験手順と条件について検討し,以下のように決定した。(1)アカパンカビの発芽した直後の菌糸から,ノボザイムによりスフェロプラストを作成する。(2)pMTRプラスミドをHindIIIで切断し,直線状化したプラスミドを使って上記スフェロプラストを形質転換する。(3)形質転換体をハイグロマイシンをふくむ培地上で選択しシングルコロニーをひろってサブカルチュアする。(4)生育した形質転換体のメチルトリプトファン耐性を調べる。(5)相同的組み換え体(ハイグロマイシン耐性で同時にメチルトリプトファン耐性)と思われるものを遺伝的に分析する。野生株をもちいての実験結果は,形質転換体100あたり相同的組み換えをおこしていると思われるものは3〜5であることが約500の形質転換体を分析して明らかになった。また減数分裂異常株としてすでに知られているmei-2株では相同的組み換えは約500の形質転換体からはみつからず,これらの株では相同的組み換え機構が欠損していることが明らかになった。一方相同的組み換え以外の組み換えはmei-2株でも高い頻度でおこっていた。このことから相同的組み換え機構と非相同的組み換え機構のメカニズムの違いを明らかにするための糸口が得られたと考えている。なお多くのDNA修復欠損株における相同的,非相同的組み換え頻度については現在分析中である。
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