| 研究概要 |
イネ,タバコ,およびソラマメの緑葉,ならびにイネ,タバコ,およびダイズの培養細胞からmRNAを分離精製し,cDNAを調製し,プラスミドcDNAライブラリーを構築した.酵母,大腸菌,動物培養細胞を含む種々の生物のDNA修復酵素遺伝子の保存性の高い配列領域から作製したセンスおよびアンチセンスプライマーを用いて,各種植物のcDNAに対してPCR法を適用し,PCR増幅産物のゲル電気泳動により各種修復酵素遺伝子と相同性の高いDNA配列の存在を調査確認した後,PCR増幅したDNA断片を大腸菌プラスミドベクターに組み込んでプラスミド"enriched"cDNAライブラリーを作製した.各種生物DNA修復酵素遺伝子の別の保存性の高い領域から作製したオリゴプローブを用いたハイブリダイゼーションによりポジティブクローンをスクリーニングした.
得られたイネ,タバコ,およびダイズ由来のポジティブクローンを用いて修復能欠損の大腸菌,インフルエンザ菌,および酵母,ならびに除去修復能を欠く大腸菌および酵母を形質転換し,相補性をもとにDNA修復能を相補する遺伝子を含むクローンの調査を行なった.修復能欠損株の相補が認められたのは,大腸菌の場合のみであった.酵母修復能欠損大腸菌を相補したポジティブクローンのDNA断片をサブクローニングし制限酵素地図を作製し塩基配列を決定し,アミノ酸配列を推定した.配列既知の他の生物のDNA修復酵素遺伝子およびその遺伝子産物とのアミノ酸配列を比較した.ポジティブクローンを用いて,イネおよびタバコプロトプラストに遺伝子導入し植物細胞中での遺伝子発現を確認する予定である.
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